梅啟享 曾悅 陸穎影

Fundprogram：National Natural Science Foundation of China(81200322，81600500)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見且預(yù)后較差的疾病之一，它的發(fā)病機(jī)制一直屬于研究熱點(diǎn)。目前多認(rèn)為它的發(fā)生是由于胰酶酶原在胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的提前激活所致，而胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活被認(rèn)為與自噬紊亂有關(guān)。作為AP中胰腺腺泡細(xì)胞的早期事件，自噬活性的調(diào)節(jié)可影響AP病情的嚴(yán)重程度[1]。高三酰甘油血癥在胰腺炎發(fā)病因素中名列第3位，是促進(jìn)胰腺炎重癥化的一個重要因素[2]。有研究發(fā)現(xiàn)自噬可能參與高脂誘導(dǎo)的疾病進(jìn)程[3]。然而目前高脂因素對于胰腺腺泡細(xì)胞自噬影響的研究尚屬空白。自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)蛋白的表達(dá)在自噬的發(fā)生發(fā)展過程中尤為重要，其中定位于自噬體膜的微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3， LC3)、與自噬溶酶體功能相關(guān)的溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome associated membrane protein 2，LAMP-2)以及識別降解底物相關(guān)的p62被認(rèn)為是自噬作用的標(biāo)志物，它們的改變預(yù)示了自噬活性的改變[4]。本研究觀察AP及高脂血癥相關(guān)性AP胰腺腺泡細(xì)胞自噬的變化，探討高脂對AP時自噬活性的影響。

材料和方法

一、動物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組

40只雄性SD大鼠，SPF級，體重200～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。按數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis， ANP)組、高脂血癥(hyperlipidemia，HL)組、高脂血癥性ANP(hyperlipidemia ANP，HANP)組，每組10只。對照組給予正常飲食喂養(yǎng)；ANP組給予正常飲食喂養(yǎng)2周后采用胰膽管逆行注射3.5%牛黃膽酸鈉溶液的方法制備ANP模型；HL組給予高脂飼料(正常飼料77%+豬油20%+膽固醇3%)喂養(yǎng)2周；HANP組給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后同上述方法制備ANP模型。對照組和HL組腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。各組大鼠于喂養(yǎng)2周后尾靜脈采血，分離血清，置-20℃保存。造模后48 h處死大鼠，腹主動脈采血，分離血漿，置-20℃保存；取胰腺組織，部分立即置液氮保存，部分用10%甲醛固定備用。

二、方法

1．血三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、淀粉酶水平檢測：血標(biāo)本送上海市第一人民醫(yī)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測TG、TC及淀粉酶水平。

2．胰腺組織病理檢查：取固定的胰腺組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下讀片，并參照Schmidt等[5]的標(biāo)準(zhǔn)對胰腺組織進(jìn)行病理評分。

3．胰腺組織LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、LAMP-2蛋白檢測：應(yīng)用RIPA裂解液提取胰腺組織總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)測定蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、LAMP-2蛋白表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。兔抗大鼠LC3Ⅰ、LC3Ⅱ購自CST公司，兔抗大鼠p62購自Proteintech公司，兔抗大鼠LAMP-2購自Abcam公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000；羊抗兔IgG-HRP二抗購自碧云天公司，工作濃度1∶2 000。最后ECL(Millipore公司)化學(xué)發(fā)光，X片曝光成像。應(yīng)用天能Tanon 5200全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量，并計(jì)算LC3Ⅱ/Ⅰ比值。

4．胰腺腺泡細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體觀察：取液氮保存的胰腺組織標(biāo)本，切取大約1 mm×1 mm×1 mm立方體，洗去殘留的血液和組織液后迅速放入新鮮3%的戊二醛(pH7.4)固定4 h以上，而后置入 1%的鋨酸固定液。常規(guī)按電鏡切片方法行超薄切片，厚度約70 nm。經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，在日本JEM1230透射電鏡下隨機(jī)選取10個不同視野，觀察并記錄每個視野內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、血清TG、TC、淀粉酶水平的變化

對照組、HL組、ANP組、HANP組血清TG水平分別為(0.36±0.17)、 (0.72±0.37)、(0.28±0.13)、(0.82±0.49)mmol/L，TC分別為(1.54±0.25)、(2.07±0.45)、(1.70±0.18)、(1.97±0.06)mmol/L。兩高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠的TG、TC水平均顯著高于兩正常飼料喂養(yǎng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TG：t值分別為3.455、3.288，P值均<0.01；TC：t值分別為2.916、4.502，P值均<0.05)，表明高脂血癥大鼠模型成功建立。

對照組、HL組、ANP組、HANP組血淀粉酶活性分別為(1 818±167)、(1 895±132)、(4505.60±549.16)、(4 830±328)U/L，對照組與HL組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ANP和HANP組則較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為12.417、14.012，P值均<0.01)，提示ANP造模成功。

二、胰腺組織病理學(xué)改變

對照組和HL組的胰腺組織無明顯病理改變，病理評分基本為0分。ANP組和HANP組胰腺組織均出現(xiàn)不同程度的水腫、出血、壞死和炎性浸潤(圖1)。ANP組胰腺組織病理評分顯著高于對照組，HANP組胰腺病理評分顯著高于HL組及ANP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表1)。

圖1 對照組(1A)、ANP組(1B)、HL組(1C)、HANP組(1D)大鼠胰腺組織病理改變(HE ×200)

組別只數(shù)總評分水腫出血壞死炎癥浸潤對照組100．20±00．20±000．45 0．45 HL組100．40±0．20±0．20±000．540．45 0．45ANP組105．60±2．20±0．90±1．10±1．40±0．54a0．28 0．420．420．42HANP組108．00±2．90±1．60±1．40±2．20±0．71bd0．42c0．42c0．42c0．76c

注：與對照組比較，aP<0.01；與HL組比較，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.05，dP<0.01

三、胰腺組織的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)改變

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量可以判斷自噬的活性。透射電鏡觀察顯示，對照組細(xì)胞核呈卵圓形，細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)中細(xì)胞器形態(tài)正常，未見自噬體，自噬活性較弱。ANP組細(xì)胞核呈不規(guī)則形，線粒體有輕度腫脹，可見“C”形的雙層膜結(jié)構(gòu)樣的自噬小體及包含降解物的自噬體，并出現(xiàn)自噬小體和溶酶體融合現(xiàn)象，溶酶體內(nèi)可見吞噬內(nèi)容物，自噬活性大大增強(qiáng)。HL組細(xì)胞核呈卵圓形和不規(guī)則形，細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較完整，有疑似自噬小體，自噬活性較弱。HANP組細(xì)胞核呈不規(guī)則形，染色質(zhì)部分凝集，細(xì)胞器形態(tài)較完整，可見分泌顆粒，有疑似自噬小體，自噬活性相對ANP組受到抑制(圖2)。

對照組、ANP組、HL組、HANP組的自噬體數(shù)量分別為(0.30±0.58)、(4.00±1.00)、(0.67±0.58)、(1.70±0.58)個，ANP組顯著多于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖2 對照組(2A)、ANP組(2B)、HL組(2C)、HANP組(2D)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)自噬體及自噬溶酶體(A、B、C×10 000，D×5 000)

四、胰腺組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

對照組大鼠胰腺組織p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ低表達(dá)，LAMP-2高表達(dá)。ANP組大鼠胰腺組織p62表達(dá)及LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較對照組增高，LAMP-2表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.062、7.737、3.619，P值均<0.05)。HSAP組大鼠胰腺組織p62表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值較HL組和ANP組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為23.35、6.801、4.187、19.44，P值均<0.01)，LAMP-2表達(dá)與HL組和ANP組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖3)。

表2 各組LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62、LAMP-2蛋白表達(dá)

注：與對照組比較，aP<0.05；與HL組比較，bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.01

討 論

高脂血癥作為AP病因僅次于膽源性和酒精性因素，高脂血可使胰腺炎趨向重癥化，然而其具體機(jī)制尚未完全闡明[6]。Guo等[7]報(bào)道，在3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化過程中可以通過靶向調(diào)節(jié)自噬來影響細(xì)胞的分化，表明自噬可能與肥胖、脂肪代謝紊亂有關(guān)。Dall′Armi 等[8]認(rèn)為脂質(zhì)和脂質(zhì)代謝酶可以通過控制哺乳動物TOR(mTOR)途徑上的信號級聯(lián)來負(fù)調(diào)節(jié)自噬的啟動。

圖3 對照組(1)、ANP組(2)、HL組(3)、HANP組(4)胰腺組織蛋白表達(dá)

自噬通過對細(xì)胞器的有效調(diào)控可以保持胰腺腺泡細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常分泌功能[9]。Diakopoulos等[10]通過構(gòu)建自噬相關(guān)基因ATG-5缺陷的小鼠證明自噬對于胰腺的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，認(rèn)為自噬的損傷是胰腺炎致病的關(guān)鍵。異常自噬的發(fā)生可使得胰蛋白酶原在自噬溶酶體內(nèi)被加快激活為胰蛋白酶，使胰腺腺泡空洞聚集，并且導(dǎo)致胰酶酶原的提早活化，從而加重胰腺炎。自噬是脂質(zhì)代謝的重要途徑之一，自噬活性的降低使脂質(zhì)代謝功能障礙，促使脂質(zhì)蓄積。然而，尚無有關(guān)高脂血癥與AP中自噬相關(guān)性機(jī)制研究的報(bào)道。

溶酶體膜內(nèi)的LAMPs是一種高度糖基化的跨膜蛋白， 在保持溶酶體結(jié)構(gòu)和功能方面扮演著重要角色。它可使細(xì)胞免受酸性水解，并參與調(diào)控溶酶體與自噬體的融合，對自噬進(jìn)程有重要影響。溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP-2)被認(rèn)為是自噬體與溶酶體的降解和融合的重要蛋白。Zhu等[11]通過注射精氨酸制備AP模型，發(fā)現(xiàn)LAMP-2的表達(dá)下降，認(rèn)為溶酶體與自噬體的融合障礙是AP異常自噬發(fā)生的原因。LC3是自噬體形成過程中的重要功能蛋白，在自噬啟動中發(fā)揮著重要作用。它存在著兩種互相轉(zhuǎn)化的形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3 Ⅱ定位于自噬囊泡體膜上，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可以反映自噬的活性。在自噬降解過程中，p62/SQSTM1是自噬降解能力的重要評價(jià)指標(biāo)[12]。因此，LC3、p62、LAMP2的表達(dá)變化可以代表自噬活性的改變。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，ANP組自噬相關(guān)蛋白LC3、p62表達(dá)增加，LAMP-2表達(dá)下降，證明胰腺炎癥反應(yīng)中自噬增強(qiáng)，且自噬溶酶體功能發(fā)生了障礙，HANP組LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62表達(dá)較ANP組下降，提示胰腺自噬活性降低，表明在高脂因素影響下，自噬活性被抑制。但HANP組與ANP組LAMP-2表達(dá)未見明顯差異，提示高脂因素的作用可能與溶酶體對自噬的調(diào)控作用無顯著相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，AP時胰腺腺泡細(xì)胞出現(xiàn)自噬小體，并隨著胰腺炎的病情程度加重，自噬的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，自噬小體體積增大，數(shù)量增多，出現(xiàn)自噬小體和溶酶體的融合現(xiàn)象[13]。本研究通過透射電鏡觀察，ANP組可見“C”形的雙層膜結(jié)構(gòu)樣的自噬小體及包含降解物的自噬體，出現(xiàn)自噬小體和溶酶體融合現(xiàn)象，HANP組有疑似自噬小體，自噬活性發(fā)生了改變。HANP組的胰腺病理損傷較對照組和ANP組更嚴(yán)重，然而，它的自噬活性被相對抑制，提示高三酰甘油血癥可能參與了AP異常自噬的發(fā)生發(fā)展過程，并進(jìn)一步導(dǎo)致疾病重癥化。

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