曾曉莎， 龐向東， 江 虹

(長江師范學院化學化工學院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

蘋果酸具有改善記憶、預防老年性癡呆、有較高抗氧化性、抗惡性細胞增殖及化學防護的作用，還有利于氨基酸吸收，現已成為新一代食品酸味劑，并廣泛用于食品工業(yè)中。 蘋果中富含蘋果酸，在人體內具有重要代謝意義。目前，測定蘋果酸的方法主要有：高效液相色譜法[1 - 7]、氣相色譜法[8]、紫外-可見分光光度法[9]、電化學法[10 - 11]及液-質聯用[12 - 13]等。高效液相色譜法和氣相色譜法，前處理較麻煩、且儀器偏貴，不易普及；紫外-可見分光光度法靈敏度不高；電化學法的重現性欠佳。本工作用近年新發(fā)展起來的瑞利光散射(RLS)技術來研究蘋果酸含量的檢測，尚未見相關文獻報道。實驗發(fā)現，在堿性溶液中，維多利亞藍B 可與蘋果酸作用使瑞利光散射顯著增強，且蘋果酸在一定的質量濃度范圍內，其質量濃度與體系的瑞利散射增強程度(ΔIRLS)呈線性關系。將該方法用于鮮蘋果中蘋果酸含量的測定，并與高效液相色譜法(GB/T5009,157-2003)對照，結果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計(日本，日立公司)，測定狹縫5.0 nm；pHS-3C 精密酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。

蘋果酸(MAA,上海麥克林生化科技有限公司)標準溶液：134.1 mg/L，冰箱4 ℃ 保存，用時用水稀釋100倍。維多利亞藍B(VIB，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖溶液：pH=3.0～9.6的系列緩沖溶液(0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計測定而配成)。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸鎦水。

1.2 實驗方法

準確加入3.0 mL 1.0×10-4mol/L 維多利亞藍B溶液于10 mL 具塞比色管中，再依次加入 1.0 mL pH=9.02的Tris-HCl緩沖溶液和適量的 1.341 mg/L 蘋果酸標準溶液或樣液，用水稀至刻度，搖勻，放置25 min后，在熒光光度計上以λex=λem=220 nm進行同步掃描，求出368 nm 波長處體系的RLS強度(IRLS)及試劑空白的RLS強度(I0)，計算ΔIRLS。

2 結果與討論

2.1 蘋果酸與維多利亞藍B 的RLS光譜特征

圖1 蘋果酸與維多利亞藍B的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of malic acid and vitoria blue B1.MAA(0.134 mg/L);2.VIB(3.0×10-5 mol/L);3-7.MAA(0.000,0.0671,0.134,0.201,0.268 mg/L)-VIB(3.0×10-5 mol/L);pH=9.02.

圖1表明：蘋果酸的RLS 十分微弱(曲線1)，維多利亞藍B 較微弱(曲線2)，而維多利亞藍B 的堿性溶液其RLS 顯著增強，并產生新的RLS光譜(曲線3)。當在曲線3溶液體系的基礎上加入不同濃度的蘋果酸標準溶液后，由于維多利亞藍B 是一種三苯甲烷類堿性染料，而蘋果酸(2-羥基丁二酸)羧酸上的H+離解后變成羧酸根離子，于是維多利亞藍B 與蘋果酸通過靜電引力結合生成二元離子締合物。生成的締合物的最大 RLS 峰位于368 nm，在此波長下RLS 強度隨著蘋果酸濃度的增大而增強，蘋果酸在一定質量濃度范圍內，與締合物 ΔIRLS呈良好的線性關系，故該方法可用于蘋果酸的定量分析。

2.2 反應條件的選擇

2.2.1溶液pH值室溫下考察了不同pH 值的 Tris-HCl緩沖溶液對二元締合反應的影響。圖2表明：在pH=8.5～9.4 范圍內，締合物的 ΔIRLS值較大，靈敏度較高。實驗用pH=9.02 的Tris-HCl緩沖溶液，適宜用量為1.0 mL。

2.2.2維多利亞藍B溶液的濃度室溫下考察了不同濃度的維多利亞藍B 溶液對二元締合反應的影響。圖3表明：當維多利亞藍B 溶液的濃度在(2.5～3.5)×10-5mol/L 范圍內時，締合物的 ΔIRLS較大，在此范圍外，維多利亞藍B 的濃度過大或過小時，ΔIRLS均會降低。原因是：當維多利亞藍B 溶液濃度過大時，其自身的聚集作用會使RLS 減弱，當維多利亞藍B 溶液濃度過小時，因反應不完全，也會使RLS 減弱。故實驗用3.0 mL 1.0×10-4mol/L維多利亞藍B 溶液。

圖2 pH值的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSMAA:0.134 mg/L;VIB:3.0×10-5 mol/L.

圖3 維多利亞藍B溶液濃度的影響Fig.3 Effect of concentration of vitoria blue B on ΔIRLSMAA:0.134 mg/L;pH=9.02.

2.2.3試劑的加入順序室溫下考察了1.2節(jié)中的各試劑在不同加入順序時對二元締合反應的影響。結果表明：按實驗方法中的加入順序為最佳，此時締合物的 ΔIRLS相對較大，靈敏度較高。實驗按最佳加入順序進行。

2.3 反應時間及締合物的穩(wěn)定性

考察了368 nm 波長處，反應時間對二元締合反應的影響。結果表明：蘋果酸與維多利亞藍B的反應在25 min 內即可完全，穩(wěn)定時間至少1.5 h。實驗選在 25 min后測定。

2.4 標準曲線

按實驗方法配制蘋果酸的標準系列溶液并掃描RLS光譜，制作工作曲線(圖4)。該方法的一元線性回歸方程為：ΔIRLS= 6.1983+5200c(mg/L)，相關系數r=0.9998，線性范圍為0.002～0.27 mg/L，檢出限為0.0018 mg/L(n=11)。

2.5 方法的選擇性

圖4 標準曲線Fig.4 Calibration curveVIB:3.0×10-5 mol/L;pH=9.02.

3 分析應用

3.1 樣品溶液的制備

分別取1#～3#重慶不同市場市售蘋果多個，削皮，去核，榨汁并攪勻，準確稱取1#果汁14.2325 g，2#果汁 13.4632 g 和3#果汁 12.5754 g，過濾，濾液分別置于1 000 mL容量瓶中，用水定容。然后移取各定容液10 mL 分別置于1 000 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得待測液。

3.2 樣品測定及加標回收試驗

取上述待測樣液 1#～2#各2.0 mL，3#3.0 mL，分別置于10 mL 具塞比色管中，按實驗方法加入其它試劑溶液，各平行配制5份。同時做加標回收試驗(n=5)。由標準曲線或回歸方程可求得待測樣液中蘋果酸的含量，從而可求得蘋果樣中蘋果酸的含量，測定結果與高效液相色譜(HPLC)法(GB/T 5009.157-2003)對照，結果見表1。

表1 樣品分析結果及回收試驗(n=5)

4 結論

用維多利亞藍B 作探針的瑞利光散射技術，可以快速測定鮮蘋果中蘋果酸的含量。方法簡便，有高的靈敏度和好的選擇性，線性范圍較寬，樣品處理簡單、安全，測定結果與國家標準方法基本一致，可用于蘋果中蘋果酸的快速測定。

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