樂 淵， 李春麗*， 張振山， 吳南村， 劉春華

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南?？?571101)

植物生長調(diào)節(jié)劑是一類與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，按作用方式可分為生長促進(jìn)劑、生長延緩劑和生長抑制劑。其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用可有效調(diào)節(jié)作物的生育過程，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性等目的[1]。但若使用不規(guī)范卻會使作物過快增長，或使生長受到抑制甚至死亡，進(jìn)而影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和消費者安全。近年來有媒體對果蔬植物生長調(diào)節(jié)劑的問題反復(fù)炒作，“激素農(nóng)產(chǎn)品”的報道時有耳聞，嚴(yán)重影響民眾的消費信心，沖擊了果蔬產(chǎn)業(yè)。

蓮霧(Syzygiumsamarangense(Blume) Merr.et Perry)是桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠果樹，其果實具有特殊的芳香，肉質(zhì)清脆可口，深受消費者喜愛，但不耐貯藏，室溫貯藏4 d后商業(yè)品質(zhì)迅速下降。利用植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)蓮霧果實產(chǎn)期，讓果品分散上市，能獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益[2 - 3]。目前，國內(nèi)外已有報道利用氣相色譜法、液相色譜法、免疫法等方法測定植物生長調(diào)節(jié)劑，但這些方法往往費時較長、靈敏度不夠或者檢測的分析物種類少[4 - 8]。QuEChERS方法于2003年被Anastassiades等開發(fā)出來，具有回收率高、穩(wěn)定性強(qiáng)和被分析物范圍廣等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域[9]。本研究擬利用QuEChERS方法凈化蓮霧提取液，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測蓮霧中氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑。方法具有快速、準(zhǔn)確度高、成本較固相萃取(SPE)低廉等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Exion LC超高效液相色譜儀、TripleQuad 4500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國,AB SCIEX公司)，配有電噴霧離子源(ESI)和Analyst 3.0工作站；AL204型電子分析天平(瑞典，梅特勒托利多公司)；T25型分散機(jī)(德國，IKA公司)；LXJ-Ⅱ型B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

多效唑(Paclobutrazol,純度98.5%)、矮壯素(Chlormequat Chloride,純度99.0%)、噻苯隆(Thidiazuron,純度99.7%)、6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA,純度99.0%)、烯效唑(Uniconazole,純度98.0%)、氯吡脲(Forchlorfenuron,純度98.7%)、胺鮮酯(2-Diethylaminoethyl Hexanoate,DA-6,純度98.5%)、助壯素(Mepiquat Chloride,純度99.1%)、2，3，5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic Acid,TIBA,純度99.0%)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D,純度99.0%)、對氯苯氧乙酸(4-Chlorophenoxyacetic Acid,4-CPA,純度99.7%)、赤霉素(Gibberellic Acid,GA3,純度98.0%)、3-吲哚丁酸(3-Indolebutyric Acid,IBA,純度99.9%)、萘乙酸(1-Naphthaleneacetic Acid,NAA,純度98.0%)、抗倒酯(Trinexapac Ethyl,純度99.0%)、脫落酸(Abscisic Acid,ABA,純度98.5%)標(biāo)準(zhǔn)品，均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；色譜純甲醇、乙腈、甲酸購自美國Fisher公司；吸附劑乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)購自美國Agilent公司；C18吸附劑、石墨化炭黑(GCB)購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)及0.22 μm過濾膜過濾的純化水。

蓮霧樣品購自海南省?？谑心媳彼l(fā)市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將上述氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在-18 ℃避光保存，有效期3個月。取空白蓮霧樣品按1.3方法進(jìn)行前處理，得到空白蓮霧基質(zhì)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別用甲醇和空白蓮霧基質(zhì)溶液稀釋成濃度為5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

蓮霧樣品經(jīng)去核取可食部分，用組織搗碎機(jī)搗碎，裝入潔凈容器內(nèi)，密封后于-18 ℃下保存。準(zhǔn)確稱取10.00 g均質(zhì)試樣于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈(含1%甲酸)，18 000 r/min均質(zhì)2 min，再加入1.0 g NaCl，渦旋1 min，然后以5 000 r/min的離心5 min。取上層乙腈溶液1.00 mL于預(yù)先加有50 mg C18粉末和150 mg無水MgSO4的離心管，冰水浴冷卻2 min后渦旋1 min，再以10 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器工作條件

UPLC條件：ACQUITY BEH C18柱(50×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min。流動相：A為乙腈，B為含5 mmol乙酸銨水溶液。梯度洗脫條件：0～0.5 min，5%A；0.5～2.5 min，5%～70%A；2.5～4.5 min，70%A；4.5～4.6 min，70%～5%A；4.6～5 min，5%A。

ESI-MS/MS條件：離子源：電噴霧離子源；離子化電壓：5 000～4 500 V；溫度：550 ℃；氣簾氣：30 psi；噴霧氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；碰撞氣：8 psi。多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM 分析的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS工作條件的優(yōu)化

在電噴霧電離模式下，以流動注射方式分別對氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑的單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對各自的子離子進(jìn)行全掃描，每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子對(奈乙酸選擇1對特征離子對)，并進(jìn)行MRM參數(shù)的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。在上述質(zhì)譜條件下，以乙腈和含5 mmol乙酸銨的水溶液作為流動相，氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑可獲得較好的分離度及較高的響應(yīng)值。

2.2 提取條件的選擇

選擇了乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙腈和含1%甲酸的乙腈溶液等進(jìn)行考察。稱取10.0 g空白樣品，添加0.10 mL 1 μg/mL的16種植物生長調(diào)節(jié)劑的混標(biāo)后，分別用10 mL上述5種溶劑進(jìn)行提取實驗。結(jié)果表明：含1%甲酸的乙腈提取效果最好，16種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率高，基質(zhì)干擾少；用丙酮提取時，基質(zhì)干擾較多，不利于后續(xù)的凈化；用乙酸乙酯和二氯甲烷提取時，部分調(diào)節(jié)劑(脫落酸、氯吡脲)提取效果較差；用乙腈提取時，部分酸性調(diào)節(jié)劑(2,4-二氯苯氧乙酸、對氯苯氧乙酸、萘乙酸、脫落酸)回收率中等，不如含1%甲酸乙腈高。因此本文采用含1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

QuEChERS方法常用的吸附劑有PSA、C18、GCB、氨丙基粉和碳納米管等[10 - 11]。在吸附劑選擇時，本文探索了5種凈化方案：50 mg PSA和150 mg無水MgSO4；25 mg GCB和150 mg無水MgSO4；50 mg PSA、50 mg C18和150 mg無水MgSO4；50 mg PSA、25 mg GCB和150 mg無水MgSO4；50 mg C18粉和150 mg無水MgSO4。取空白樣品，添加0.10 mL 1 μg/mL的16種植物生長調(diào)節(jié)劑的混標(biāo)，按2.2方法提取后采用上述5種方案凈化。結(jié)果表明5種條件下矮壯素、助壯素和赤霉素的回收率均低于30%，原因可能是這3種調(diào)節(jié)劑熱穩(wěn)定性差，凈化時無水MgSO4吸水放熱導(dǎo)致回收率低。凈化時采用冰水浴降溫后，回收率均有大幅提高。第二和第四種方案下，6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、烯效唑和氯吡脲的回收率低于30%，其中氯吡脲回收率只有4%。第一和第三種方案下，3-吲哚丁酸和萘乙酸的回收率低于50%。第五種方案下，16種生長調(diào)節(jié)劑回收率均在70%～130%之間。原因可能是6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、烯效唑和氯吡脲為平面結(jié)構(gòu)，被GCB吸附，3-吲哚丁酸和萘乙酸為有機(jī)酸，被PSA吸附。因此本文采用C18和無水MgSO4作為吸附劑凈化蓮霧提取液。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

移取一定量的植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以空白蓮霧基質(zhì)提取液為稀釋溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用1.4中方法進(jìn)行測定，以儀器響應(yīng)峰面積對各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度在5.0～500.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以10信噪比(S/N=10)計算定量限(LOQ)，16種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限和定量限見表2。

表2 氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限(LODs)和定量限(LOQs)

2.5 方法的精密度和回收率

取空白蓮霧樣品，按低、中、高3個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)實驗，按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，平行測定5次，計算回收率和精密度，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，16種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率在71.0%～124%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.6%～11.2%之間，符合方法學(xué)要求。

表3 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

本文通過測定16種植物生長調(diào)節(jié)劑在基質(zhì)匹配溶液中的響應(yīng)值(A)及其在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值(B)，得到基質(zhì)效應(yīng)：ME=(A-B)/B×100%。表3為蓮霧基質(zhì)中16種植物生長調(diào)節(jié)劑在高、低兩個濃度(500 ng/mL、50 ng/mL)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，氯吡脲、抗倒酯、2，3，5-三碘苯甲酸和萘乙酸存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，但干擾程度較低；脫落酸存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，低濃度時干擾程度較低，高濃度時干擾強(qiáng)烈；6-芐基腺嘌呤等11種植物生長調(diào)節(jié)劑在高低濃度都存在強(qiáng)烈的基質(zhì)抑制效應(yīng)[12]。

表4 氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑在蓮霧提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

為消除基質(zhì)效應(yīng)所帶來的干擾，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，常采用標(biāo)準(zhǔn)加入法、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、使用分析保護(hù)試劑和同位素內(nèi)標(biāo)法等[13 - 14]。在農(nóng)藥殘留分析中，最常見的是用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行消除。從結(jié)果分析可知，當(dāng)只需要測定氯吡脲、抗倒酯、2，3，5-三碘苯甲酸和萘乙酸時，由于基質(zhì)效應(yīng)較弱可直接使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量；當(dāng)還需要測定其他植物生長調(diào)節(jié)劑時，就需要使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，才能定量準(zhǔn)確。

2.7 實際樣品的測定

采用本實驗建立的方法測定了采集于?？谑心媳彼l(fā)市場的21份蓮霧樣品，均未檢出氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑。

3 結(jié)論

本研究建立QuEChERS法前處理，UPLC-MS/MS法快速檢測蓮霧中氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑。實驗優(yōu)化了UPLC與MS的采集參數(shù)、確定了吸附劑的種類及用量，并考察了基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高、成本較固相小柱萃取低廉等優(yōu)點，可用于蓮霧中氯吡脲等16種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測，具備一定的推廣價值。

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