張洪非， 羅彥波， 李翔宇， 姜興益， 朱風鵬， 龐永強陳 歡， 韓書磊， 付亞寧， 劉 彤， 侯宏衛(wèi)

(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南鄭州 450001)

生物堿是植物的次生代謝產(chǎn)物，約四分之一的植物都會產(chǎn)生生物堿[1]。據(jù)文獻報道在馬鈴薯，西紅柿、茄子和辣椒中能檢測到低水平的煙堿含量(10 μg/kg以下)[2 - 9]。除了煙堿外的其它生物堿叫做次要生物堿，如降煙堿、新煙草堿、假木賊堿、麥斯明、可替寧、2,3′-二吡啶、3,3′-二吡啶、二烯煙堿、N-甲基假木賊堿、二烯降煙堿等。其中，降煙堿、新煙草堿和假木賊堿的含量相對較高，研究也最多[6]。次要生物堿在煙草中廣泛分布，但在西紅柿、土豆等食物中未檢出煙堿之外的其他生物堿[7]。

煙草中主要生物堿的測定大多采用氣相色譜法(GC)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[10 - 11]，應用高效液相色譜(HPLC)分離測定煙草中生物堿的報道較少[12 - 13]，毛細管電泳分析的方法也有報道[14]。目前未見食源性植物中次要生物堿的檢測方法報道?！稛煵菁盁煵葜破?煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》(YC/T383-2010)針對煙草產(chǎn)品開發(fā)了檢測方法，由于煙堿在煙草中的含量達到3%，因此對于生物堿含量較低的西紅柿和茄子等不能檢測。同時由于茶葉、牛肝菌等樣品基質(zhì)較為復雜，含有色素較多，因此需要優(yōu)化凈化步驟。

QuEChERS的樣品前處理技術(shù)[15]在植物檢測中廣泛應用，但當其應用于沸點低的萃取溶劑時易導致發(fā)熱量太大從而影響目標物的測定結(jié)果。為了驗證食源性植物(牛肝菌、茶葉、馬鈴薯，番茄，茄子和甜辣椒等)中煙堿及次要生物堿是否由污染產(chǎn)生，以及評估從膳食暴露攝入煙堿及次要生物堿的潛在風險，本研究采用改進QuEChERS-氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法(GC/MS)，測定上述食源性植物中煙堿和次要生物堿及其含量分布。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6890N氣相色譜/5975B質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)；PAS凈化試劑包(美國，Agilent公司)。

煙堿、降煙堿與可替寧儲備溶液：分別準確稱取約15.0 mg煙堿及可替寧、降煙堿，置于3個25 mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。麥斯明儲備溶液：準確稱取約10.0 mg麥斯明，置于25 mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。假木賊堿和新煙堿混標儲備溶液：準確稱取約15.0 mg假木賊堿、10.0 mg新煙堿，置于25 mL的棕色容量瓶中，加入約10 mL萃取溶液完全溶解后，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿的混和標準溶液：分別移取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0 mL的麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿混標儲備液于不同的10 mL棕色容量瓶中，再準確加入200 μL內(nèi)標儲備液，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。內(nèi)標2-甲基喹啉溶液：800 μg/mL。煙堿、降煙堿標準溶液：分別移取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50 mL的各標準儲備溶液于10 mL棕色容量瓶中，再準確加入200 μL內(nèi)標儲備液，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。6種目標物和內(nèi)標2-甲基喹啉均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。甲基叔丁基醚、乙腈、三氯甲烷(色譜純，韓國德山化工有限公司)。所用水由Milli-Q系統(tǒng)(Milford,MA,USA)制得。

1.2 儀器條件

GC/MS條件：色譜柱為DB-35 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱程序：初始溫度100 ℃，保持3.0 min，再以8 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，總運行時間：33 min。進樣量3 μL;分流進樣，分流比為：5∶1；高純He為載氣；接口和離子源溫度為300 ℃和200 ℃；電離源為EI源；電離能量70 eV；溶劑延遲時間8 min；目標物及內(nèi)標的選擇離子監(jiān)測(SIM)模式參數(shù)如表1所示。

表1 目標物和內(nèi)標的SIM參數(shù)和保留時間

1.3 樣品制備

稱取2.0 g已粉碎的樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 10%的NaOH溶液浸潤樣品，靜置10 min。取10 mL 0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚到離心管中，加入200 μL 2-甲基喹啉內(nèi)標溶液，于旋渦混合器上以2 000 r/min振蕩1 min。移取1.0 mL上清液于2 mL凈化離心管中(內(nèi)含150 mg無水MgSO4，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑)，于旋渦混合器上以2 000 r/min振蕩2 min，以5 000 r/min離心3 min。取上清液過0.22 μm有機相濾膜后，進行GC-MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取方式的選擇

本研究考察了QuEChERS技術(shù)的高速渦旋振蕩提取及超聲提取，結(jié)果顯示采用渦旋振蕩提取結(jié)果均高于超聲提取(圖1)，因此最終選擇渦旋振蕩的萃取方式。

2.2 萃取溶劑的選擇

本研究優(yōu)化了萃取溶劑。當使用正己烷等非極性溶劑做萃取劑時，樣品提取液中的極性共萃取基質(zhì)較少，但對煙堿等目標物的萃取效率較差。常用的溶劑中，丙酮萃取的雜質(zhì)較多，而且對MgSO4具有一定的溶解性，溶液中含鹽對色譜柱不利；乙酸乙酯對部分極性目標物萃取效率不高；乙腈作為QuEChERS前處理方法中的一種通用極性溶劑，可同時萃取極性和非極性目標物，而且有利于下一步的凈化。同時還考察了三氯甲烷及甲基叔丁基醚的萃取效率。結(jié)果表明，甲基叔丁基醚與三氯甲烷的萃取效率比較接近，乙腈稍低，實驗選擇甲基叔丁基醚作為萃取溶劑。

2.3 緩沖體系的選擇

圖1 不同提取方式的提取效果Fig.1 Extraction efficiency of different extraction modes

Anastassiades等[15]提出了適用于水果和蔬菜的多殘留分析方法，該方法發(fā)展迅速，并不斷改進以適用于不同的目標物，但原方法對堿敏感的目標物會受基質(zhì)影響而使回收率變差。Anastassiades等后來采用加入檸檬酸鹽的方法以獲得穩(wěn)定的pH，該方法被歐盟認可為標準方法(EN 15662)[16]。本研究考察了檸檬酸緩沖鹽體系在食源性樣品基質(zhì)中的提取效率。檸檬酸緩沖鹽體系為：4 g無水MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3Cit·2H2O+0.5 g Na2HCit·1.5H2O。這個體系樣品基質(zhì)的pH值為5.0～5.5，而本研究的目標物為煙堿類物質(zhì)，需要在堿性條件下才能游離出來；同時測定了樣品不加緩沖鹽試劑包的pH為9.0，加入緩沖鹽試劑包的pH在7.0左右，不利于目標物的游離。另外，由于緩沖鹽試劑包中含有4 g MgSO4，在吸水的同時釋放了大量的熱量，使溶劑溫度達到55 ℃，由于甲基叔丁基醚的沸點為55.2 ℃，因此可以明顯觀察到溶液的沸騰，這樣會使溶劑和目標物造成了損失，實驗結(jié)果也驗證了這個現(xiàn)象。如圖2所示，以未加緩沖鹽體系的樣品中目標物結(jié)果進行歸一化，發(fā)現(xiàn)加入緩沖鹽試劑包的結(jié)果偏低，尤其對于麥斯明，結(jié)果偏低50%左右。因此，本方法對QuEChERS法進行改進，采用不加緩沖鹽試劑包而采用渦旋振蕩的萃取方法。

2.4 凈化吸附劑的選擇

圖2 目標分析物在緩沖體系中的回收率Fig.2 Recovery of the analyte in buffer system

在QuEChERS前處理方法中，常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等。其中，PSA可除去提取液中的碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類和少量的色素；C18可去除脂肪和酚類化合物；GCB主要用于除色素?；|(zhì)中的主要干擾物為脂肪酸、有機酸、碳水化合物、甾醇等極性干擾物，而PSA作為弱陰離子交換吸附劑，對于上述極性干擾物的吸附提供最好的凈化效果。水分含量對PSA的凈化效果有著至關(guān)重要的作用，水分含量越低，PSA的凈化效果越好。并且無水MgSO4的除水效果要好于Na2SO4。因此在PSA中添加C18和/或GCB，考察不同凈化劑組合對提取液的凈化效率及對目標物的吸附效應，目標物在不同凈化劑作用下的回收率見圖3。從結(jié)果來看，最終選擇High pigment(25 mg PSA+7.5 mg GCB+150 mg MgSO4(每mL提取液))作為凈化劑。

圖3 三種PSA的凈化效果Fig.3 Clean-up effect of 3 PSA

2.5 基質(zhì)效應

圖4 6種目標物在3種不同提取液中的基質(zhì)效應Fig.4 Matrix effects of 6 analytes in three different extracts

與液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的基質(zhì)效應主要來自于離子源不同，氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的基質(zhì)效應主要來自氣相部分，而且以基質(zhì)增強效應為主。減小基質(zhì)效應應用最多的是用基質(zhì)匹配標準溶液建立標準工作曲線，對基質(zhì)效應進行校正。三個樣品基質(zhì)匹配標準溶液按實驗方法進行配制，通過對比標準溶液和基質(zhì)匹配標準溶液的信號差異來考察三種不同的前處理方法得到的萃取液中目標物的基質(zhì)效應。6種目標物的基質(zhì)效應見圖4。由圖4可知，大部分目標物在提取液中均呈現(xiàn)顯著的基質(zhì)增強效應。三種基質(zhì)中，牛肝菌提取液的基質(zhì)效應最強(對幾種不同種類的目標物都是如此)，表明其基質(zhì)含量最大；而西紅柿萃取液基質(zhì)效應相對較弱。因此，本研究采用加入和目標物結(jié)構(gòu)類似的2-甲基喹啉作為內(nèi)標對基質(zhì)效應進行校正。

2.6 方法確認

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)、線性范圍和重現(xiàn)性。分別以目標物濃度及其峰面積與內(nèi)標峰面積之比為橫、縱坐標繪制工作曲線。如表2所示，6種目標物的檢出限在0.06～0.18 mg/kg之間，定量限在0.07～0.60 mg/kg之間，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.993。

表2 目標物的線性范圍、工作曲線、檢出限和定量限

將牛肝菌、茶葉和西紅柿3種樣品加標后用本方法測定，如表3所示，目標物的平均回收率在84.1%～109.1%之間。為了考察本方法的重現(xiàn)性，對3種濃度的樣品，以1 d內(nèi)5次平行測定，及連續(xù)3 d測定，計算日內(nèi)和日間相對標準偏差(RSD)。如表4所示，目標物的日內(nèi)及日間精密度分別小于9.4%和8.2%，其中目標物在中濃度和高濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值不高于8.4%，低濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值略高。

表3 實際樣品中目標物的回收率

表4 目標物在不同濃度下的精密度

2.7 實際樣品分析

為了驗證本方法在實際樣品中的應用效果，采用本方法處理16個茶葉樣品、6個牛肝菌樣品、3個西紅柿樣品、1個土豆樣品、1個茄子樣品和1個辣椒樣品并進行測定。6個牛肝菌樣品中煙堿、降煙堿、假木賊堿和可替寧均有檢出，麥斯明檢出率16.7%；新煙堿均未檢出，見表5。16個茶葉樣品中煙堿、降煙堿、假木賊堿和可替寧均有檢出；麥斯明檢出率25%；新煙堿均未檢出。3個西紅柿樣品中煙堿均有檢出；同樣降煙堿、假木賊堿、麥斯明、新煙堿和可替寧也全部有檢出，含量略有不同，其中可替寧含量最高，新煙堿含量最低。土豆和茄子樣品中煙堿均有檢出，含量分布在1.20～1.60 mg/kg之間；同樣降煙堿、假木賊堿和麥斯明也全部有檢出，含量略有不同，新煙堿和可替寧均未檢出。辣椒樣品煙堿、降煙堿、假木賊堿、麥斯明和新煙堿也有檢出，含量和土豆、茄子一致；可替寧未檢出。

表5 檢測樣品目標物含量(mg/kg)

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通過與文獻方法[17 - 19]比較，發(fā)現(xiàn)牛肝菌和茶葉中煙堿的數(shù)據(jù)以前未見報道。西紅柿等茄科植物中的煙堿含量報道較多，由于前期研究集中在20世紀90年代，那時的檢測條件和現(xiàn)在差異較大，同時由于所測定的樣品種屬的不一致，以及樣品成熟度的不一致(含水率不同)，也導致數(shù)據(jù)存在一定的差異性。

3 結(jié)論

采用改進QuEChERS方法，以0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液對樣品中的生物堿進行渦旋提取，用High pigment PSA對提取物進行凈化，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，建立了食源性植物(牛肝菌、茶葉和西紅柿)中煙堿和5種次要生物堿的檢測方法。本方法具有樣品前處理簡單、凈化能力強和靈敏度高的優(yōu)點。采用本方法處理16個茶葉樣品、6個牛肝菌樣品、3個西紅柿樣品、1個土豆樣品、1個茄子樣品和1個辣椒樣品并進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙堿在所有樣品中均有不同程度的檢出，降煙堿、新煙堿、麥斯明、假木賊堿和可替寧在部分樣品中有檢出。

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