丁 佳， 呂莎平， 劉躍進(jìn)， 吳志民， 李勇飛， 潘浪勝

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭 411105)

芹菜素作為一種天然黃酮類化合物，因其獨(dú)特的藥理功能和生物活性被廣泛地應(yīng)用于藥物研究中，研究表明芹菜素具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]和抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]等作用。另外，芹菜素還與能Bcl-2在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮重要作用[5]。因此，研究芹菜素的提取分離與應(yīng)用具有十分重要的意義。

分子印跡技術(shù)是一種基于分子印跡聚合物(MIPs)對(duì)特定目標(biāo)化合物的選擇吸附作用[6 - 7]的技術(shù)。多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種新型的高強(qiáng)度碳纖維材料，具有機(jī)械性能好、電學(xué)性能強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[8]。研究表明在碳納米管表面接枝MIPs是可行的[9 - 10]，這種新型的材料MWCNTs-MIPs，既有碳納米管超強(qiáng)的力學(xué)性能和電學(xué)性能，又有MIPs專一選擇識(shí)別性能，使得分子印跡點(diǎn)位完全暴露在基質(zhì)表面，克服了空間位阻的影響，提高分子印跡材料的選擇吸附效率。同時(shí)，以碳納米管為微固相萃取材料的固相萃取技術(shù)的專一性較強(qiáng)[11 - 13]。

本文以羧基化多壁碳納米管為基材，結(jié)合分子印跡技術(shù)，以芹菜素作為模板分子，成功制備了一種基于碳納米管的新型印跡復(fù)合材料(MWCNTs-MIPs)，并通過掃描電鏡(SEM)，傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜和比表面積分析(BET)對(duì)該材料進(jìn)行表征。另外，對(duì)聚合物的靜態(tài)吸附性能與選擇性進(jìn)行研究，同時(shí)還對(duì)固相萃取方法進(jìn)行了重現(xiàn)性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

PerkinElmer Series200高效液相色譜儀(PerkinElmer)；DF-10型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KQ220E型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；DZ-CII真空干燥箱(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限責(zé)任公司)；羧基化碳納米管(內(nèi)徑：20～30 nm；長(zhǎng)度：10～30 μm，北京德科島金科技有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，阿拉丁試劑有限公司)；氯化亞砜、丙烯酰胺(AM)(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；二甲基甲酰胺(DMF，廣東汕頭市西隴化工廠)。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 碳納米管印跡材料的制備

1.2.1MWCNTs-CH=CH2的制備參照文獻(xiàn)方法[14]，稱取0.45 g MWCNTs-COOH溶解于50 mL氯化亞砜中，超聲15 min后加熱回流攪拌24 h。待反應(yīng)結(jié)束后，采用減壓蒸餾法回收二氯亞砜，得到目標(biāo)產(chǎn)物MWCNTs-COCl。再將產(chǎn)物MWCNT-COCl和1.2 g AM溶于100 mL DMF中，超聲15 min后，于25 ℃ 下回流攪拌24 h。待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，真空抽濾，得到粗產(chǎn)物。然后分別用0.12 mol/L HCl和蒸餾水洗滌至中性，70 ℃真空干燥過夜，得MWCNTs-CH=CH2。

1.2.2納米管芹菜素分子印跡聚合物的制備稱取0.1081 g芹菜素和0.1139 g AM，溶解于80 mL丙酮中，超聲30 min，然后加入0.2 g的 MWCNT-CH=CH2，繼續(xù)超聲20 min并靜置1 h，使模板分子與功能單體充分反應(yīng)。然后依次加入1.58 g交聯(lián)劑EGDMA和20 mg AIBN。通氮?dú)?0 min后，于60 ℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。待反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，真空抽濾后，收集濾液采用減壓蒸餾法回收丙酮。濾餅用乙醇反復(fù)洗滌，以除去未參與反應(yīng)的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等雜質(zhì)。

初洗后的濾餅裝于索氏提取器中，以甲醇-乙酸混合液(9∶1，V/V)作洗脫劑，回流提取24 h后，洗去模板分子，然后用蒸餾水洗滌至中性。將得到的產(chǎn)物于80 ℃下真空干燥24 h。非印跡材料(MWCNT-NIPs)的制備除不加模板分子外，其它步驟均與上述相同。

1.3 聚合物的靜態(tài)吸附性能實(shí)驗(yàn)

為了研究多壁碳納米管芹菜素分子印跡聚合物的吸附性能，考察了振蕩時(shí)間對(duì)吸附容量的影響。具體步驟如下：分別稱取8等份20 mg的MWNT-MIPs和MWCNTs-NIPs，加入到10 mL 0.2 mmol/L的芹菜素乙醇溶液中，然后放入恒溫箱中分別振蕩10、30、60、90、200、300、400和500 min，取上層清液，微孔濾膜過濾后用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定芹菜素的濃度，平行測(cè)定三次，取平均值。計(jì)算其對(duì)芹菜素的吸附容量Q；Q=(c0-c) ×V/m,式中Q表示聚合物的吸附容量(mmol/g)；c和c0分別表示芹菜素的初始濃度和吸附后上清液中芹菜素的濃度(mmol/L)；V表示溶液的體積(mL)；m表示質(zhì)量(g)。繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.4 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

1.5 印跡聚合物固相萃取

稱取50 g MWCNTs-MIPs，采用干法裝入帶有篩板的固相萃取柱中，上端用玻璃棉封堵。首先，選用1 mL芹菜素?zé)o水乙醇溶液上樣，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的淋洗液進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最佳體積分?jǐn)?shù)的淋洗液；然后取溶于乙醇的芹菜提取物溶液上樣，先用最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液淋洗，再用無(wú)水乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，用HPLC法進(jìn)行分析。

1.6 HPLC檢測(cè)條件

色譜條件：Diamonsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm；迪馬科技有限公司)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%的磷酸溶液(70∶30，V/V)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；柱溫：室溫。

精密稱取5.4、16.2、27.0、37.8、54.0 mg芹菜素，以無(wú)水乙醇為溶劑，配制體積為200 mL，濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液。HPLC法檢測(cè)進(jìn)樣量均為6 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡(SEM)表征

采用SEM分別對(duì)MWCNTs-COOH、MWCNT-CH=CH2、MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs進(jìn)行形貌表征。從圖1可以看出，MWCNTs-COOH呈單一的納米管狀或小的束狀，管徑大約為20 nm。同樣在放大20倍下，MWCNTs-CH=CH2均勻變大，這表明雙鍵已經(jīng)均勻接枝在碳納米管上。從MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的SEM圖中可看出，經(jīng)過接枝修飾的MIPs和NIPs管徑都均勻增大，但兩者相差不大，約為30～40 nm。與圖1(B)比較可知，MWCNTs-MIPs的管徑大于MWCNT-CH=CH2的管徑，這說(shuō)明聚合物已經(jīng)均勻的接枝在碳納米管表面，印跡層厚度為10～20 nm。

圖1 MWCNTs-COOH(A)、MWCNTs-CH=CH2(B)、MWCNTs-MIPs(C)和MWCNTs-NIPs(D)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of MWCNTs-COOH(A)，MWCNTs-CH=CH2(B)，MWCNTs-MIPs(C)and MWCNTs-NIPs(D)

2.2 紅外光譜分析

圖2 MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of MWCNTs-COOH,MWCNTs-CH=CH2 and MWCNTs-MIPs

圖2為MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外光譜圖。從圖2中可以看出，MWCNTs-COOH的紅外光譜圖的吸收峰最少，這是因?yàn)樗休^簡(jiǎn)單的有機(jī)結(jié)構(gòu)。在MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外圖譜中，3 050～3 600 cm-1處有較寬的彌散吸收峰，這是-OH和C-H吸收峰疊加所致。在MWCNTs-CH=CH2的紅外譜圖中，1 628 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)雙鍵的特征吸收峰；而MWCNTs-MIPs的紅外譜圖中，1 455～1 600 cm-1附近出現(xiàn)苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，800～1 000 cm-1間是-(CH2)n-的搖擺振動(dòng)峰，2 800～3 000 cm-1處是 -CH3的特征峰，1 270～1 050 cm-1處是-C-O-C-的振動(dòng)吸收峰；此外，1 730 cm-1處的是酯羰基吸收峰，強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這是由于MWCNTs-MIPs高分子層是EGDMA和AM共聚而來(lái)。以上結(jié)果說(shuō)明MIPs被成功接枝到MWCNTs上，形成對(duì)芹菜素具有獨(dú)特識(shí)別功能的MWCNTs-MIPs。

2.3 比表面積分析

采用比表面分析(BET)測(cè)定了MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的比表面積、孔徑和總孔容。由表1可知，MWCNTs-MIPs的比表面積、總孔容都大于MWCNTs-NIPs，由于提供了較大的空間，因此更有利于模板分子的吸附，并且吸附容量要大于傳統(tǒng)方法合成的印跡聚合物。

表1 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的BET表征結(jié)果

圖3 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Adsorption kinetics of MWCNTs-MIPs and MWCNTs-NIPs

2.4 模板分子對(duì)印跡聚合物吸附性能的影響

圖3是MWCNTs-MIPs及MWCNTs-NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。從圖中可以看出，MWCNTs-MIPs在前20 min內(nèi)吸附容量迅速增加，在200 min時(shí)已基本達(dá)到平衡。而MWCNTs-NIPs的吸附容量100 min達(dá)到最大。這是由于MWCNTs-MIPs 的孔穴由芹菜素分子所印跡，生成較大的孔穴有利于模板分子的傳質(zhì)，因此在吸附實(shí)驗(yàn)開始時(shí)呈現(xiàn)出較快的吸附速率。但隨著時(shí)間的增加，當(dāng)MWCNTs-MIPs表面的識(shí)別位點(diǎn)被結(jié)合以后，由于其向MWCNTs-MIPs孔穴的傳質(zhì)有一定的空間位阻使吸附速度逐漸下降。而MWCNTs-NIPs中由于不存在與模板分子結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的有序排列的立體孔穴，因此它主要是通過非模板聚合物表面的非特異性吸附作用來(lái)吸附芹菜素，所以很快就能達(dá)到吸附平衡。

2.5 印跡聚合物的選擇性能

由表2可知，MIPs對(duì)芹菜素產(chǎn)生了較為明顯的印跡效果，而對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物木犀草素的吸附性相對(duì)較差。這是由于在聚合過程中，以芹菜素為模板分子，使得MIPs中存在與芹菜素結(jié)合的功能基團(tuán)，同時(shí)也留下了與芹菜素的立體結(jié)構(gòu)能互補(bǔ)的特殊空穴，這些均使得MIPs對(duì)芹菜素有著特殊的識(shí)別性能。由此可見，MWCNTs-MIPs對(duì)模板分子芹菜素有著較好的選擇性吸附性能。

表2 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的選擇性系數(shù)

2.6 淋洗液的優(yōu)化

在淋洗的步驟中，考慮到乙醇極性較大、溶解性能好，能夠溶解較多的非特異吸附的雜質(zhì)，因此我們采用了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(50%、25%和10%)進(jìn)行淋洗液的篩選。結(jié)果表明，當(dāng)采用10%的乙醇溶液作為淋洗液時(shí)，淋洗效果最好，它能有效地除去雜質(zhì)而保留芹菜素。

2.7 芹菜提取物中芹菜素的固相萃取

圖4 芹菜提取液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of celery extracts1-apigenin；(a)extracts of celery；(b)leachate；(c)eluent.

取1 mL芹菜提取液的無(wú)水乙醇溶液上樣后，先用10%乙醇溶液淋洗，再用無(wú)水乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每1 mL收集一次洗脫液，然后進(jìn)行HPLC法分析，芹菜提取物的色譜圖如圖4所示。結(jié)果表明，經(jīng)10%乙醇溶液淋洗和經(jīng)無(wú)水乙醇洗脫的固相萃取操作后，洗脫液中芹菜素的含量有所提高，芹菜素得到有效純化和富集。

2.8 印跡聚合物固相萃取方法的重現(xiàn)性

為了研究碳納米管分子印跡聚合物固相萃取方法的重現(xiàn)性，碳納米管分子印跡聚合物固相萃取1次后，按照上述操作條件重復(fù)操作5次，其樣品純度和回收率見表3。由表3可知，碳納米管分子印跡聚合物重復(fù)操作5次，分離效果基本不變，能使芹菜素的純度由0.53%提高至90.93%，回收率可達(dá)到95.84%，對(duì)芹菜素有較好的分離富集效果，富集因子高達(dá)171.6。

表3 固相萃取方法重現(xiàn)性(n=5)

3 結(jié)論

本文成功制備了一種基于碳納米管的新分子型印跡復(fù)合材料(MWCNTs-MIPs)，并通過SEM、FT-IR和BET對(duì)聚合物進(jìn)行表征。MWCNTs-MIPs對(duì)芹菜素呈現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力和選擇識(shí)別能力，其吸附容量遠(yuǎn)大于MWCNTs-NIPs。對(duì)芹菜提取物進(jìn)行了固相萃取研究，結(jié)果表明該技術(shù)具有良好的重現(xiàn)性，對(duì)芹菜素富集因子高達(dá)171.6，為芹菜素的分離富集提供了一條新的途徑。

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