潘姝歷, 蘇 敏, 郭 婷, 張宇昊, 馬 良

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一種常見(jiàn)霉菌毒素，屬2B類致癌物[1]，它具有腎臟和肝臟毒性、基因毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性[2 - 4]，其毒性僅次于黃曲霉毒素B1(AFB1)。OTA可以廣泛污染農(nóng)產(chǎn)品和食品，尤其是霉變的谷物、咖啡、豆類以及葡萄制品，是食品安全領(lǐng)域危害最大的污染物之一[5]。目前，常采用聯(lián)合免疫技術(shù)[6 - 9]與高效液相色譜(HPLC)等方法[10 - 13]進(jìn)行OTA的檢測(cè)，但這類方法雖然靈敏度高、重復(fù)性好，但成本較高、耗時(shí)較長(zhǎng)且抗體不易保存，需要較大的樣品量。

離子液體(Ionic Liquid,IL)是一類新型室溫熔融鹽，因其“低毒性”而得到廣泛的應(yīng)用[14]。分散液-液微萃取(Dispersive Liquid-liquid Microextraction,DLLME)是基于分析物在小體積萃取劑與樣品溶液間分配平衡過(guò)程，構(gòu)建離子液體-分散劑-水三元乳濁體系，通過(guò)增大離子液體與分析物的接觸面積，以獲得較高的富集倍數(shù)，可提高檢測(cè)靈敏度[15 - 16]，還可以避免使用傳統(tǒng)DLLME中常用的高毒性萃取劑氯仿。鑒于IL-DLLME操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、成本低、富集效果好，同時(shí)可替代傳統(tǒng)的高毒氯化物，近幾年在農(nóng)獸藥檢測(cè)以及金屬離子的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[17 - 21]。目前，IL-DLLME在真菌毒素方面的研究較少，主要集中在谷物、飼料的檢測(cè)[22 - 24]，而針對(duì)OTA的檢測(cè)，主要圍繞酒類樣品[25 - 26]。

本研究以高OTA污染風(fēng)險(xiǎn)的葡萄汁為研究對(duì)象，構(gòu)建離子液體-分散系-水三元體系，提高OTA提取效率和富集倍數(shù)，克服真菌毒素在極性溶液為主的檢測(cè)體系中其熒光猝滅導(dǎo)致靈敏度降低的問(wèn)題，提高檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，結(jié)合HPLC法建立葡萄汁中OTA的快速檢測(cè)方法，高靈敏度檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品及食品中真菌毒素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配有熒光檢測(cè)器；5810臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf公司)；QL-901渦旋震蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

OTA標(biāo)準(zhǔn)品(>99%，新加坡PriboLab公司)；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4MIM][PF6])(>98%)、1-甲基-3-辛基咪唑六氟磷酸鹽([C8MIM][PF6])(>98%)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C6MIM][PF6])(≥98%)(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。甲醇、乙腈、冰乙酸、丙酮、無(wú)水乙醇均為色譜純(天津四友有限公司)。

濃縮葡萄汁購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理準(zhǔn)確移取5.00 mL樣品，加冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5，然后快速注入100 μL萃取劑 [C8MIM][PF6]與0.8 mL分散劑(丙酮)的混合溶液，渦旋震蕩3 min后，4 000 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確移取40 μL離心管底部的離子液體到進(jìn)樣瓶的內(nèi)插管中，用等體積的甲醇稀釋，待測(cè)。

1.2.2色譜分離條件色譜柱：ZORBAX EXTEND C18柱(150×4.6 mm，5.0 μm;美國(guó)安捷倫有限公司)；流動(dòng)相：乙腈-2%乙酸水溶液(50∶50,V/V);流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：460 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄汁前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1萃取劑及用量選擇研究了3種離子液體[C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]和[C8MIM][PF6]對(duì)OTA的萃取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)[C4MIM][PF6]由于溶解度問(wèn)題而無(wú)法在離心管底部形成沉淀，不適合作為本研究的萃取劑。[C6MIM][PF6]與[C8MIM][PF6]作為萃取劑時(shí)，OTA的萃取回收率較高，均大于75%，但[C6MIM][PF6]為萃取劑時(shí)色譜分離效率較好，色譜峰形比[C8MIM][PF6]尖銳，半峰寬較窄，且[C6MIM][PF6]粘度相對(duì)較小有助于分離，故選用[C6MIM][PF6]為萃取劑。不同體積的[C6MIM][PF6]對(duì)OTA回收率影響的結(jié)果如圖1所示，隨著萃取劑用量的增大，OTA的回收率顯著增大，100 μL時(shí)萃取回收率達(dá)到最高，為103.33%。因此，萃取劑用量選取100 μL。

2.1.2分散劑及用量選擇實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮4種有機(jī)溶劑對(duì)OTA的萃取效果。結(jié)果顯示：乙腈、乙醇、丙酮萃取回收率均超過(guò)70%，且以丙酮為分散劑時(shí)萃取回收率最高，為84.76%，所以選擇丙酮作為本實(shí)驗(yàn)的分散劑。在0.5～0.9 mL體積范圍比較了不同體積丙酮對(duì)OTA萃取回收率的影響。當(dāng)丙酮量為0.7、0.8 mL時(shí)OTA萃取回收率均高于90%，故選擇分散劑體積為0.7 mL。

2.1.3pH值的影響實(shí)驗(yàn)研究了pH=2.5～4.5時(shí)OTA的萃取回收率，結(jié)果如圖2所示。pH為2.5時(shí)萃取效率較低，分析原因?yàn)榈蚿H條件下萃取劑受到鹽溶效應(yīng)影響，難以形成乳濁體系，導(dǎo)致最終萃取劑的體積減少，萃取回收率降低。而當(dāng)pH高于pKa值時(shí)，一部分OTA易以離子狀態(tài)存在，導(dǎo)致萃取回收率降低。因此本研究采用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5。

圖1 萃取劑用量對(duì)OTA回收率影響(cOTA=3 μg/kg)Fig.1 Effect of extraction dosage on recoveries of OTA(spiked at 3 μg/kg)

圖2 溶液pH對(duì)OTA回收率的影響(cOTA=3 μg/kg)Fig.2 Effect of pH on recoveries of OTA(spiked at 3 μg/kg)

2.1.4離子強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同含量的NaCl來(lái)改變水相的離子強(qiáng)度，結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度增加，萃取回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在NaCl濃度為50 g/L時(shí)萃取回收率達(dá)到最高，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)50 g/L時(shí)萃取回收率降低。分析原因可能是因?yàn)闃悠啡芤簼舛冗^(guò)大，降低了目標(biāo)物在IL中的溶解度，導(dǎo)致萃取回收率降低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇NaCl濃度為50 g/L。

2.1.5渦旋時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)考察了不同渦旋時(shí)間對(duì)萃取回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)渦旋時(shí)間為1 min時(shí)，萃取時(shí)間較短，萃取不完全，萃取回收率較低。而渦旋時(shí)間增加到3 min后，可獲得較高的萃取回收率。當(dāng)渦旋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，7 min時(shí)萃取回收率有所下降，分析原因可能是有一部分萃取劑附著在了離心管壁。因此，渦旋時(shí)間確定為3 min。

2.2 方法學(xué)研究與評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確移取適量2.5 mg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為0.10、0.25、1.00、2.50、5.00、7.00、10.00、15.00、20.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定，以質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：OTA在0.02～20.00 μg/kg范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=9344.3X-607.98，R2=0.9995，線性關(guān)系良好。檢出限(S/N=3)為0.05 μg/kg，定量限(S/N=10)為0.17 μg/kg。

對(duì)不含目標(biāo)物的空白濃縮葡萄汁進(jìn)行0.5、1.0、2.0 μk/kg3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，OTA的平均加標(biāo)回收率范圍為83.88%～105.32%，富集倍數(shù)為8.92～9.95，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.17%～7.83%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于葡萄汁中OTA的檢測(cè)。

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

在各大型超市隨機(jī)抽取3種不同品牌的葡萄汁樣品，采用本方法進(jìn)行提取，HPLC-FLD分析。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，葡萄汁中OTA含量均未超過(guò)歐盟最大限量標(biāo)準(zhǔn)10 μg/kg。濃縮葡萄汁A、B中的OTA含量分別為0.03±0.01 μk/kg(n=5)、0.22±0.01 μk/kg(n=5)。

圖3 葡萄汁樣品經(jīng)IL-DLLME處理后的色譜圖Fig.3 Chromatograms of grape juice samples analysed using IL-DLLME with HPLC-FLDa is sample spiked at 2 μg/kg of OTA;b is concentrated grape juice B;c is concentrated grape juice A;d is grape juice.

3 結(jié)論

本研究采用離子液體[C6MIM][PF6]代替氯仿作為萃取劑，渦旋輔助萃取，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，建立了葡萄汁中OTA的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)方法。該方法通過(guò)構(gòu)建離子液體-分散劑-水的三元乳濁體系，提高了OTA的檢測(cè)靈敏度，實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果均未超過(guò)歐盟最大限量標(biāo)準(zhǔn)10 μg/kg。該方法經(jīng)濟(jì)環(huán)保、快捷高效，避免了有機(jī)溶劑的大量使用，且能滿足復(fù)雜基質(zhì)如果汁中OTA的檢測(cè)要求。

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