伍桃英

程云輝1

趙良忠2

歐陽林3

許 宙1

(1.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410076；2.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；3.邵陽學院第二附屬醫(yī)院普外科，湖南 邵陽 422000)

牛乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)以及多種維生素，是自然界賜予人類最理想的天然食品之一[1]。乳糖是乳類中特有的碳水化合物，牛乳中乳糖含量為4.6%～5.0%，占總糖量的99%以上[2]。正常生理條件下，乳糖經(jīng)小腸內(nèi)乳糖酶作用，水解為葡萄糖和半乳糖才能被人體吸收，但是當人體內(nèi)乳糖酶缺乏或活力不夠時，攝入含乳糖的乳制品易發(fā)生乳糖吸收不良甚至乳糖不耐癥，這是制約乳及乳制品消費的主要原因之一[3]。β-半乳糖苷酶能將牛乳中的乳糖水解成葡萄糖、半乳糖[4]。目前酶法水解乳糖制備低乳糖奶的方法有2種：① 采用低溫長時水解法，即在線添加乳糖酶后，采用4～6 ℃水解12～20 h；② 采用高溫短時水解法，即采用中高溫酶，在30～40 ℃水解2～4 h。馬夫俠[5]、秦立虎[6]、常忠義[7]、王輝[8]等采用這2種方法對低乳糖奶的制備進行了研究，但其乳糖水解率大多在60%～70%，只能一定程度上緩解乳糖不耐受癥狀。因此，采用β-半乳糖苷酶制備高水解率低乳糖奶，對滿足乳糖不耐癥患者的消費需求及促進中國乳品工業(yè)的發(fā)展仍具有十分重要的意義。本研究擬以乳糖水解率為考察指標，利用游離的β-半乳糖苷酶對牛乳中的乳糖進行水解，通過響應面優(yōu)化，確定高水解率低乳糖奶水解的最佳工藝，并采用HPLC對低乳糖乳奶中的糖類進行分析，以期為高水解率低乳糖奶工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：湖南亞華乳業(yè)有限公司；

Lactozyme：3 000 U/mL，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；

Maxilact：3 000 U/mL，帝斯曼食品配料公司；

K3-T：5 000 U/g，山東天賜國際貿(mào)易有限公司；

Lactose F：300 U/g，日本天野酶制品株式會社；

葡萄糖試劑盒：上?？菩兰夹g(shù)研究所；

葡萄糖、半乳糖、乳糖：色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

試驗用水為實驗室自制蒸餾水。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters600型，沃特世科技(上海)有限公司；

可見分光光度計：SpectrumLab 22PC型，上海棱光技術(shù)有限公司；

臺式pH計：Delta320型，上海君達儀器儀表有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司；

可調(diào)式移液槍(20～200 μL)：Finnpipette型，熱電(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：CS202型，重慶實驗設(shè)備廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 低乳糖奶的制備工藝

1.3.2 操作要點

(1) 配制復原乳：由于牛奶中乳糖含量為4.6%～5.0%，此次研究采用全脂奶粉按照1∶7 (g/mL)的復水比配制成復原乳，乳糖及其水解率的測定采用碘量法[9]，按式(1)計算乳糖水解率。

(1)

式中：

α——乳糖水解率，%；

c0——單質(zhì)碘標準溶液的濃度，mol/L；

V0——測定時準確移取的單質(zhì)碘的體積，mL；

cs——Na2S2O3溶液的濃度，mol/L；

V1、V2——酶解前、后牛奶濾液消耗Na2S2O3的體積，mL。

(2) 酶活測定：采用葡萄糖氧化酶試劑盒法[10]。

(3) 乳糖水解：復原乳經(jīng)95 ℃/15 s殺菌后冷卻到適宜溫度，以一定比例添加乳糖酶，于恒溫水浴振蕩器中水解一定時間。

1.3.3 HPLC法檢測牛奶中的糖類 采用高效液相色譜儀對牛奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖進行定量檢測，樣品經(jīng)12 000 r/min離心后直接檢測，具體的HPLC條件[11]：

(1) 檢測葡萄糖、半乳糖的HPLC條件：Sugar-Pak I(6.5 mm×300 mm)色譜柱；流動相：純水；檢測器靈敏度：4；柱溫：85 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL。

(2) 檢測乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件：Hpersil APS(4.6 mm×250 mm)色譜柱；流動相：乙腈/水(75/25)；檢測器靈敏度：4；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖及低聚半乳糖分別按式(2)～(5)計算：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：

c1、c2、c3、c4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

c10、c20、c30、c40——標樣中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的濃度，mg/mL；

S1、S2、S3、S4——樣品中葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖的峰面積，mV·min；

S10、S20、S30、S40——葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖標樣的峰面積，mV·min。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備低乳糖奶的工藝研究

β-半乳糖苷酶的酶活采用葡萄糖氧化試劑盒測定，酶活見表1。

Lactase F乳糖酶為酸性乳糖酶，在中性的鮮乳或復原乳中酶活不高；Lactozyme、Maxilact、K3-T均為中性乳糖酶，其中Lactozyme、K3-T在40，45 ℃酶活較高且活性相當，適用于牛乳中乳糖的分解，但K3-T較 Lactozyme價格高昂，因此，綜合選擇酶活較高、價格較低的Lactozyme乳糖酶作為制備低乳糖奶的游離酶種。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以[E]/[S]、水解溫度及時間為因素，以乳糖水解率為響應值，采用響應面法[12-14](RSA)尋求酶解最優(yōu)工藝參數(shù)，RSA試驗設(shè)計與結(jié)果分別見表2、3。

表1 4種β-半乳糖苷酶的酶活Table 1 The enzyme activities and prices of three kinds of β-galactosidase

表2 RSA試驗因素水平Table 2 Experimental factors and levels of RSA

表3 RSA試驗結(jié)果Table 3 Experimental results of RSA

采用Design Expert 8.0.5B軟件對RSA試驗結(jié)果進行二次回歸分析，得到方程：

α=84.89+3.98A-0.80B+4.50C+0.12AB+1.95AC+0.82BC-2.78A2-11.79B2-1.08C2。

(6)

為了進一步研究相關(guān)變量之間的交互作用并確定最優(yōu)點，通過Design-Expert繪制響應面曲線圖進行可視化分析，以水解率(α)作為響應值，分別作水解溫度與水解時間、[E]/[S]與水解溫度、[E]/[S]與水解時間關(guān)系圖，結(jié)果見圖1～3。

圖1反映了在[E]/[S]為1.25‰時，水解溫度與時間對乳糖水解率影響的響應面曲線。由圖1可知，同一溫度下，乳糖水解率隨著水解時間的增加而增大；相同[E]/[S]與水解時間下，乳糖水解率與水解溫度呈拋物線變化。當[E]/[S] 為1.25‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃、水解時間為3.0 h時，乳糖水解率最高可達90.65%。

圖2反映了在水解時間為2.5 h的條件下，[E]/[S]和水解溫度對乳糖水解率的影響。由圖2可知，隨著[E]/[S]的提高，乳糖水解率隨之增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與溫度呈拋物線變化趨勢。當[E]/[S]為1.5‰、水解溫度為37.5～40.0 ℃時，乳糖水解率可達89.13%。

表4 RSA 方差分析?Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

圖1 水解溫度與時間對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖([E]/[S]=1.25‰)
Figure 1 Response surface and contour plots surface of the effects of hydrolysis temperature and time on the hydrolysis rate of lactose

圖2 [E]/[S]與水解溫度對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖(水解時間2.5 h)Figure 2 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and Hydrolysis Temperature on the hydrolysis rate of lactose

圖3 [E]/[S]與水解時間對乳糖水解率影響的響應面與等高線圖(水解溫度40 ℃)Figure 3 Response surface and contour plots surface of the effects of [E]/[S] and hydrolysis time on the hydrolysis rate of lactose

圖3反映了在水解溫度為40 ℃條件下，[E]/[S]與水解時間對乳糖水解率的影響。由圖3可知，同一溫度下，水解相同時間，乳糖水解率隨著[E]/[S]的增加而增大；同一[E]/[S]條件下，乳糖水解率與水解時間呈正相關(guān)。當[E]/[S] 為1.5‰、水解時間為3.0 h時，乳糖水解率最高可達91.04%。

通過Design Expert軟件分析，得出水解牛乳中乳糖的最佳工藝條件為：[E]/[S]為1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時間3.0 h。在此條件下3組平行驗證實驗的平均得率為92.67%，與軟件估測值93.55%相近，說明實際情況與優(yōu)化結(jié)果能良好吻合。

2.2 HPLC法分析乳中的糖類

低乳糖奶采用RSA得到的最佳工藝制備，復原乳與低乳糖奶樣品于95 ℃殺菌5 min，冷卻后12 000 r/min離心，用HPLC直接檢測。

2.2.1 樣品中乳糖、葡萄糖、半乳糖 在檢測葡萄糖、半乳糖的HPLC條件下，首先對乳糖(RT)、葡萄糖(PTT)、半乳糖(BRT)3個標樣進行檢測，得到的色譜圖見圖4，各個標樣對應的保留時間、峰面積與濃度數(shù)值見表5。復原乳與低乳糖奶中乳糖、葡萄糖、半乳糖的HPLC圖見圖5、6。

圖4 標樣的色譜圖Figure 4 Chromatogram of standard samples

表5 標樣的檢測結(jié)果Table 5 The test results of standard samples

圖5 復原乳中糖類的HPLC圖Figure 5 The HPLC diagrams of various sugars in milk

圖6 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 6 The HPLC diagrams of various sugars in low-lactose milk

由圖5、6可知，復原乳中的糖類主要是乳糖，含量為52.343 mg/mL，不含葡萄糖，半乳糖的含量極微，濃度為0.626 mg/mL；而低乳糖奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖的含量分別為6.086，9.964，26.101 mg/mL，說明復原乳中近90%的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，生成了葡萄糖、半乳糖；但乳糖、葡萄糖、半乳糖的總和小于100%，說明還有其他糖生成。

2.2.2 樣品中乳糖、低聚半乳糖 由于乳糖在水解過程中除生成葡萄糖、半乳糖之外，還生成了其他糖，在此對低聚半乳糖進行研究。在檢測乳糖、低聚半乳糖的HPLC條件下對低聚半乳糖對照品標樣進行檢測，結(jié)果見圖7和表6。

由圖8、9可知，復原乳中93.05%的糖是乳糖，通過HPLC還檢測出了另外3種糖，其含量合計為整個糖類的6.95%；而低乳糖奶中的乳糖、低聚半乳糖的含量分別為整個糖類的3.04%和14.02%，其余為單糖。說明β-半乳糖苷酶有轉(zhuǎn)糖苷的作用，可生成功能性低聚糖。

圖7 低聚半乳糖對照品標樣的色譜圖Figure 7 Chromatogram of galacto-oligosaccharide reference standard samples

表6 低聚半乳糖對照品標樣的檢測結(jié)果?Table 6 Results of galacto-oligosaccharide reference standard samples

? 對照品中保留時間6.325 min的峰為乳糖，保留時間為5.948，6.737 min及以后出峰的為低聚半乳糖組分的峰。

圖8 復原乳中糖類的HPLC圖Figure 8 The HPLC diagrams of various sugars inreconstituted milk

圖9 低乳糖奶中糖類的HPLC圖Figure 9 The HPLC diagrams of various sugars in low lactose milk

3 結(jié)論

本試驗采用Lactozyme制備高水解率低乳糖奶，通過響應面確定最佳條件為：[E]/[S] 1.50‰、水解溫度38.06 ℃、水解時間3.0 h，在此條件下制備的低乳糖奶的乳糖水解率高達92.67%，較前人[15]研究的乳糖水解率提高了20%～30%；通過HPLC分析，證明了復原乳中90%以上的乳糖被β-半乳糖苷酶水解，同時在自制的低乳糖奶中有14.02%的低聚半乳糖生成，說明了β-半乳糖苷酶既能水解乳糖，又有轉(zhuǎn)糖苷的作用。

本試驗在乳糖水解中生成了大量的還原性單糖，其羰基與蛋白質(zhì)在滅菌過程中會發(fā)生美拉德反應，導致低乳糖奶產(chǎn)生非酶褐變，故需對低乳糖奶的褐變及其抑制進行后續(xù)研究。

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