王洪杰WANG Hong-jie

張平平1,2

歐可可1

馮 聰1

揣東華1

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384)

體力疲勞又叫軀體性疲勞，當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間從事繁重緊張的體力勞動(dòng)時(shí)，會(huì)有大量的代謝物在體內(nèi)積聚，刺激人體組織細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)，使人產(chǎn)生疲勞感[1]。緩解體力疲勞就是通過(guò)一些方法來(lái)緩解這種疲勞的感覺(jué)，從而使人感覺(jué)輕松。金絲小棗(Ziziphusjujuba)隸屬于鼠李科棗屬植物，至今已有3 000多年的栽培歷史，風(fēng)味甘美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多糖、環(huán)磷酸腺苷、生物堿類、皂苷類、黃酮類等[2]，是傳統(tǒng)的藥食兼用佳品。棗多糖有抗氧化、抗腫瘤、降低血糖和血脂、延緩機(jī)體衰老、增強(qiáng)免疫力、保肝等藥理功效[3]。雖然目前中國(guó)對(duì)棗多糖的生物活性研究較多[4-5]，但對(duì)緩解小鼠體力疲勞方面的研究不多[6-7]，且未見(jiàn)發(fā)酵對(duì)棗多糖緩解體力疲勞功效影響的報(bào)道。

本研究以金絲小棗為原料，利用酵母菌發(fā)酵棗漿，提取發(fā)酵多糖進(jìn)行緩解小鼠體力疲勞方面的研究，以期為發(fā)酵棗粉、發(fā)酵多糖在功能食品中的應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金絲小棗：產(chǎn)自山東樂(lè)陵；

安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

SPF級(jí)雄性昆明小鼠：中國(guó)食品藥品檢定研究院；

無(wú)水乙醇：分析純，南京化學(xué)試劑一廠；

三氯甲烷、苯酚：分析純，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；

正丁醇：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；

硫酸：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

苦味酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

尿素氮(BUN)、血乳酸(LD)、肝糖原(HG)、肌糖原(MG)、肌酸激酶(CK)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：JA2003型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-18S型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：LGR20-W型，北京京立離心機(jī)有限公司；

水浴鍋：HWS-28型，上海恒科學(xué)儀器有限公司；

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：ELx800型，美國(guó)MD公司；

全自動(dòng)生化分析儀：GLAMOUR3000型，美國(guó)MD公司。

1.3 方法

1.3.1 金絲小棗多糖的制備

(1) 發(fā)酵前的棗多糖：參照吉爽爽[8]提取棗多糖的方法并作改進(jìn)。金絲小棗去核打漿后按料液比1∶3(質(zhì)量比)的比例加入蒸餾水，于80 ℃水浴鍋中浸提2 h，4 000 r/min離心10 min，收集下層濾渣加入蒸餾水再水浴2 h，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，加95%乙醇，4 ℃放置24 h，取沉淀加蒸餾水溶解，過(guò)8 kD的超濾膜，截留液用Sevage法除蛋白質(zhì)，冷凍干燥(參數(shù)設(shè)置：冷阱盤(pán)管溫度-66 ℃，真空度1 Pa，捕水能力6 kg/24 h，凍干面積0.18～0.27 m2)得到棗多糖。經(jīng)硫酸苯酚法[9]測(cè)定棗多糖含量為65% 。

(2) 發(fā)酵后的棗多糖：金絲小棗去核打漿，經(jīng)滅菌處理后接種1%的酵母菌，37 ℃發(fā)酵8 h，發(fā)酵結(jié)束后放入冰箱冷凍室終止發(fā)酵。提取發(fā)酵多糖的過(guò)程同1.3.1(1)。經(jīng)硫酸苯酚法測(cè)定棗多糖含量為59%。

1.3.2 試驗(yàn)動(dòng)物條件和分組 選取6周齡、體重(19±1) g的SPF級(jí)雄性昆明小鼠56只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體重隨機(jī)分為7組并灌胃不同濃度的多糖液。正常對(duì)照組ZD(蒸餾水)，發(fā)酵前的棗多糖高劑量組WG[0.2 g/(kg·d)]、中劑量組WZ[ (0.15 g/kg·d)]、低劑量組WD[0.1 g/(kg·d)]，發(fā)酵后的棗多糖高劑量組FG[0.2 g/(kg·d)]、中劑量組FZ[0.15 g/(kg·d)]、低劑量組FD[0.1 g/(kg·d)]，規(guī)定每只小鼠每天灌胃量為0.1 mL/10 g·BW。每日下午5:00進(jìn)行一次灌胃，連續(xù)灌胃4周。

1.3.3 緩解小鼠體力疲勞的試驗(yàn)方法 末次灌胃相應(yīng)劑量的多糖后，將尾根部負(fù)荷自身體重6%鐵絲的小鼠置于游泳箱(尺寸約 60 cm × 60 cm × 50 cm)中游泳，水深約30 cm，水溫25 ℃左右，記錄小鼠從游泳到其頭部沉入溫水中8 s后，不能再露出水面的時(shí)間，即為小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間[10]11。負(fù)重方法[10]12：用等長(zhǎng)的棉線在距小鼠尾巴根部2～3 cm處系上負(fù)重鐵絲環(huán)。根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒布的《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[11]的要求記錄小鼠每日體重及力竭游泳時(shí)間，按BUN、LD、HG、MG、CK、GSH-Px、SOD等試劑盒說(shuō)明測(cè)定各指標(biāo)。

1.3.4 小鼠力竭游泳時(shí)間延長(zhǎng)率的計(jì)算

(1)

式中：

P——延長(zhǎng)率，%；

t1——試驗(yàn)組小鼠存活時(shí)間，min；

t0——正常對(duì)照組小鼠存活時(shí)間，min。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖劑量對(duì)各組小鼠體重的影響

體重變化是小鼠生長(zhǎng)發(fā)育受到影響最直接的體現(xiàn)，即反映小鼠在飼養(yǎng)期間，多糖對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響。表1為不同劑量多糖對(duì)各組小鼠體重的影響。

表1 各組小鼠體重的增量Table 1 Weight increment of mice in each group g

由表1可知，與ZD相比，各試驗(yàn)組小鼠每2周內(nèi)體重的增量有差別，但用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其分析，均無(wú)顯著性差異，即在飼養(yǎng)期間，灌胃發(fā)酵前后的棗多糖不會(huì)對(duì)小鼠的生長(zhǎng)及發(fā)育造成不良影響。

2.2 多糖劑量對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度。表2為不同劑量的多糖對(duì)各組小鼠力竭游泳時(shí)間的影響。

由表2可知，與ZD相比，各試驗(yàn)組小鼠的力竭游泳時(shí)間都有所延長(zhǎng)，WG、FG、FZ與ZD相比差異極顯著，WZ、FD與ZD相比差異顯著。說(shuō)明發(fā)酵前后的棗多糖能不同程度地緩解小鼠的體力疲勞。雖然WG、FG、FZ與ZD相比差異都極顯著，但FZ的延長(zhǎng)率更高，更能緩解小鼠的體力疲勞。

表2多糖劑量對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響?
Table 2 Effects of different doses of jujube polysaccharide on the exhaustive swimming time of mice

組別力竭游泳時(shí)間/min延長(zhǎng)率/%ZD8．33±0．89WG11．00±1．59??32．01WZ9．97±1．12?19．69WD8．93±0．547．20FG10．43±0．88??25．17FZ12．33±0．81??47．98FD10．06±0．37?20．77

? *表示與ZD相比有顯著性差異(P<0.05)，**表示與ZD相比有極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 多糖劑量對(duì)小鼠血清中BUN、LD含量的影響

能源物質(zhì)的消耗、代謝物質(zhì)的堆積是產(chǎn)生疲勞的重要原因[12]。表3為不同劑量多糖對(duì)各組小鼠BUN、LD的影響結(jié)果。

表3 多糖劑量對(duì)小鼠BUN、LD的影響?Table 3 Effects of different doses of jujube polysaccharide on the BUN, LD of mice mmol/L

? *表示與ZD相比有顯著性差異(P<0.05)，**表示與ZD相比有極顯著性差異(P<0.01)。

機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，氧供應(yīng)相對(duì)不足，BUN、LD等代謝產(chǎn)物增多，會(huì)引起肌肉收縮效率下降[13]，因此，BUN、LD是檢測(cè)疲勞程度最主要的指標(biāo)[14]。由表3可知，與ZD相比，各試驗(yàn)組小鼠血清中BUN和LD含量均有所降低。FZ小鼠血清中BUN含量與ZD相比，差異極顯著，WG、FG、FD小鼠血清中BUN含量與ZD相比，差異顯著。WG、FZ小鼠血清中LD含量與ZD相比，差異極顯著，WZ、FG小鼠血清中LD含量與ZD相比，差異顯著，且發(fā)酵多糖組的BUN含量都比棗多糖組的低，F(xiàn)Z小鼠血清中BUN、LD含量都是最低的。說(shuō)明發(fā)酵前后的棗多糖可不同程度地減少機(jī)體蛋白質(zhì)和含氮物質(zhì)的分解代謝，以提高肌肉的運(yùn)動(dòng)能力，緩解小鼠的體力疲勞，其中FZ的緩解效果最好。

2.4 多糖劑量對(duì)小鼠HG、MG含量的影響

HG和MG是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)重要的供能物質(zhì)[15]。表4為不同劑量的多糖對(duì)各組小鼠HG、MG的影響結(jié)果。

劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體的HG、MG被大量消耗以維持血糖恒定，當(dāng)HG、MG耗竭，血糖含量明顯下降，則運(yùn)動(dòng)不能持續(xù)[16]。

表4 多糖劑量對(duì)小鼠HG、MG的影響?Table 4 Effects of different doses of jujube polysaccharide on the HG, MG of mice mg/g

? *表示與ZD相比有顯著性差異(P<0.05)，**表示與ZD相比有極顯著性差異(P<0.01)。

因此HG、MG的儲(chǔ)備量直接影響小鼠負(fù)重游泳的能力，是反映疲勞程度的主要指標(biāo)[17]。由表4可知，與ZD比，各試驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的HG和MG含量均有所增加。其中，F(xiàn)Z的HG含量與ZD相比，差異顯著，其它各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WG、FZ的MG含量與ZD相比，差異極顯著，WZ、WD的MG含量與ZD相比，差異顯著。說(shuō)明發(fā)酵前后的棗多糖可通過(guò)改善機(jī)體糖代謝系統(tǒng)來(lái)達(dá)到緩解小鼠體力疲勞的作用。而且發(fā)酵后的HG含量比發(fā)酵前的高，其中FZ小鼠的HG、MG含量都是最高的，表明FZ更能緩解小鼠的體力疲勞。

2.5 多糖劑量對(duì)小鼠CK、GSH-Px、SOD含量的影響

自由基理論認(rèn)為，抗氧化與緩解體力疲勞具有一定的關(guān)系，GSH-Px活力、SOD活力、CK活力3項(xiàng)指標(biāo)能直接反映機(jī)體的抗氧化狀態(tài)和脂質(zhì)過(guò)氧化水平[18]。表5為不同劑量的多糖對(duì)各組小鼠GSH-Px、SOD、CK活力的影響結(jié)果。

表5 多糖劑量對(duì)小鼠GSH-Px、SOD、CK活力的影響?Table 5 Effects of different doses of jujube polysaccharide on the GSH-Px, SOD, CK of mice U/mL

? *表示與ZD相比有顯著性差異(P<0.05)，**表示與ZD相比有極顯著性差異(P<0.01)。

GSH-Px、SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中2個(gè)重要的酶，而CK活性的變化與機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度密切相關(guān)，是評(píng)定骨骼肌微細(xì)損傷的一個(gè)重要生理指標(biāo)[19]。由表5可知，與ZD相比，各劑量組多糖均能提高GSH-Px、SOD活力，降低CK活力，其中WG、FZ極顯著增加了GSH-Px、SOD活力，降低了CK活力。WZ顯著增加了GSH-Px、SOD活力，顯著降低了CK活力，F(xiàn)G顯著增加了GSH-Px、SOD活力，極顯著降低了CK活力，說(shuō)明發(fā)酵前后棗多糖均具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，不僅能顯著提高體內(nèi)酶系統(tǒng)的抗氧化活力，而且能夠有效清除體內(nèi)自由基并防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，減少血管壁及一些組織的損傷，進(jìn)而緩解小鼠的體力疲勞，其中WG和FZ緩解小鼠體力疲勞的效果最佳。

3 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，力竭游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以直接反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的疲勞程度，BLA、BUN、HG及MG是反映機(jī)體疲勞程度的重要生化指標(biāo)。機(jī)體通過(guò)糖酵解的方式提供能量，維持正常生活，當(dāng)機(jī)體處于長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)，會(huì)加快糖酵解速度，氧供應(yīng)會(huì)相對(duì)不足，機(jī)體啟動(dòng)無(wú)氧糖酵解過(guò)程，HG、MG大量消耗，提供能量的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的LD和BUN等蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，其在體內(nèi)堆積會(huì)直接或間接引起運(yùn)動(dòng)能力的下降，產(chǎn)生疲勞。因此，BLA、BUN含量越低，HG、MG含量越高，機(jī)體的抗疲勞能力越強(qiáng)。自由基理論認(rèn)為，抗氧化與緩解體力疲勞有一定的關(guān)系，在對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中2個(gè)重要的酶GSH-Px、SOD及CK活力進(jìn)行測(cè)定時(shí)，證實(shí)了發(fā)酵前后棗多糖不僅能顯著提高體內(nèi)酶系統(tǒng)的抗氧化活力，而且能夠有效清除體內(nèi)自由基并防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而緩解機(jī)體的體力疲勞。與對(duì)照組相比，隨著棗多糖劑量的增加，各試驗(yàn)組小鼠的力竭游泳時(shí)間都有延長(zhǎng)，體內(nèi)HG、MG含量都有不同程度的增加，BLA、BUN含量都有不同程度的降低，證明發(fā)酵前后棗多糖均具有緩解體力疲勞的作用，且發(fā)酵前的棗多糖緩解體力疲勞的功效是隨著多糖劑量的增加而增強(qiáng)的，發(fā)酵后多糖的抗疲勞功效是先增強(qiáng)再減弱的，其中發(fā)酵后棗多糖中劑量對(duì)小鼠體力疲勞的緩解效果更為明顯。

[1] 宋偉峰, 蘇俊芳, 羅淑媛.荔枝多糖抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材, 2012, 35(9): 1 485-1 487.

[2] 姬玉潔, 張平平, 王娜, 等.發(fā)酵冬棗粉與普通冬棗粉成分分析及不同處理對(duì)棗中cAMP含量變化的影響[J].食品工業(yè)科技, 2014(24): 123-127, 131.

[3] 劉曉慶.沙棗多糖純化、結(jié)構(gòu)表征及其生物活性研究[D].天津: 天津科技大學(xué), 2015: 6-9.

[4] 朱虎虎, 康金森, 玉蘇甫·吐?tīng)栠d, 等.新疆大棗汁抗小鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)疲勞作用的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(11): 232-234.

[5] 姬玉潔.發(fā)酵冬棗粉成分分析及其對(duì)小鼠免疫功能的影響[D].晉中: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 8-11.

[6] 池愛(ài)平, 陳錦屏, 熊正英.木棗多糖抗疲勞組分對(duì)力竭游泳小鼠糖代謝的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 26(4): 411-415.

[7] 丁玉松, 王忠, 馬儒林, 等.沙棗多糖抗疲勞作用及其機(jī)制的研究[J].食品科學(xué), 2010, 31(11): 255-257.

[8] 吉爽爽.棗中功能性糖的研究[D].保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 19.

[9] 魏然.圓鈴大棗多糖提取、純化及生物活性研究[D].泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 12-13.

[10] 陳慧嬋.香菇對(duì)小鼠抗疲勞、耐缺氧及抗氧化作用的研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[11] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].北京: 清華同方電子出版社, 2003: 87-93.

[12] 曹犇.木棗多糖抗小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(9): 571-574.

[13] 劉慶春, 畢珣, 劉愛(ài)兵, 等.棗環(huán)磷酸腺苷提取液對(duì)小鼠抗疲勞作用的藥效學(xué)研究[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng), 2015(1): 46-48.

[14] CHI Ai-ping, TANG Liang, ZHANG Jing, et al.Chemical composition of three polysaccharides from gynostemma pentaphyllum and their antioxidant activity in skeletal muscle of exercised mice[J].International Journal of Sport Nutrition and Exercise Metabolism, 2012, 22(6): 479-485.

[15] ANDREW D Ray, SUPRIYA Udhoji, TERRY L Mashtare.A combined inspiratory and expiratory muscle training program improves respiratory muscle strength and fatigue in multiple sclerosis[J].Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, 2013, 94(10): 1 964-1 970.

[16] 鄭飛.藍(lán)莓多糖對(duì)衰老小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及抗疲勞效果研究[J].食品科學(xué), 2014, 35(21): 249-252.

[17] 池愛(ài)平, 陳錦屏, 熊正英.木棗多糖抗疲勞組分對(duì)力竭游泳小鼠糖代謝的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 26(4): 411-415.

[18] SEN S, WINLAW D S, SHOLLER G F.Partial anomalous left pulmonary artery: report of two cases and review of literature[J].Cardiol Young, 2014, 25(5): 1-3.

[19] 池愛(ài)平, 康琛喆, 郭歡歡, 等.敗醬草多糖的組成及抗疲勞與耐缺氧作用[J].食品科學(xué), 2014, 35(21): 212-215.