任麗琦，翁潔羊，王 鑫，孫金生，李 冉

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

許多節(jié)肢動(dòng)物會(huì)發(fā)生周期性的蛻皮。當(dāng)蛻去堅(jiān)硬的、舊的外骨骼后由真皮分泌產(chǎn)生的新表皮比較柔軟，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有利，但是不能有力地抵抗病原微生物的侵染，甚至易受到其他機(jī)械損傷等，所以需要迅速進(jìn)行鞣化(黑化和硬化)。

Cottrell[1]和Fraenkel等[2]最早發(fā)現(xiàn)了鞣化激素的功能，他們認(rèn)為正常發(fā)育的紅頭麗蠅(Calliphoraerythrocephala)體內(nèi)存在某種調(diào)節(jié)因子，這種調(diào)節(jié)因子可以使剛羽化的紅頭麗蠅在頸部進(jìn)行結(jié)扎處理后，胸部和腹部的表皮仍能夠繼續(xù)鞣化。Fraenkel等[3]將該物質(zhì)命名為鞣化激素(Bursicon)。研究發(fā)現(xiàn)鞣化激素在三氯乙酸、乙醇、丙酮等溶液中均會(huì)產(chǎn)生沉淀而且不能夠成功透析，乙醇和枯草桿菌又可將其滅活，證明鞣化激素屬于蛋白質(zhì)。之后幾乎同時(shí)的2項(xiàng)研究表明鞣化激素是一種異源二聚體，由2個(gè)胱氨酸結(jié)蛋白亞基構(gòu)成，分別被命名為BURS (α)和PBURS (β)[4-5]。α和β亞基都是胱氨酸結(jié)蛋白，2個(gè)亞基的氨基酸序列中都包含11個(gè)半胱氨酸，C3和C4間的氨基酸序列均為X-G-X (X可以為任意的氨基酸)，C6和C7相鄰，C9和C10間只有1個(gè)氨基酸，α和β這2個(gè)亞基通過C6結(jié)合在一起[4]。

在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中鞣化激素的受體，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，即DLGR2，其由rickets基因編碼[6]。受體DLGR2被激活后，經(jīng)由cAMP/PKA通路調(diào)控表皮的鞣化和翅的伸展[6-8]。利用基因芯片分析方法在頸部結(jié)扎黑腹果蠅中，找到了87個(gè)受鞣化激素調(diào)控的下游基因。其中已知功能的基因大多與表皮的鞣化以及翅的伸展有關(guān)，還有7個(gè)基因與免疫調(diào)控有關(guān)[9]。鞣化激素的2個(gè)亞基還可以分別形成各自的同源二聚體并參與免疫反應(yīng)[10]。

在蛛形綱[11]、昆蟲綱[12-15]和甲殼綱[16-20]中都含有鞣化激素，而且鞣化激素主要分布在神經(jīng)細(xì)胞中[15-20]。但是其在米蝦中的分布及其蛋白結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道。米蝦屬于甲殼綱(Crustacea)、匙指蝦科(Atyidae)，具有繁殖周期短、生長(zhǎng)快、個(gè)體小等特點(diǎn)，適合作為試驗(yàn)材料。筆者選取米蝦為研究對(duì)象，觀察其胚胎的發(fā)育過程，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鞣化激素在米蝦不同組織中的分布，并利用原核表達(dá)的方式表達(dá)鞣化激素2個(gè)亞基基因的蛋白，為進(jìn)一步研究鞣化激素在米蝦中的功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1材料米蝦購(gòu)于浙江水產(chǎn)市場(chǎng)，每只體重50～100 mg，將米蝦養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室26～28 ℃的曝氣水中，每日投喂2次蝦糧，每隔2 d更換新鮮的曝氣水。

1.2主要試劑TRIzol?Reagent購(gòu)于Thermo Fisher Scientific；氯仿、異丙醇、無水乙醇等有機(jī)試劑購(gòu)于普博欣生物科技有限責(zé)任公司；TransScript?one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、ExTaq酶購(gòu)于TaKaRa；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、瓊脂糖、抗生素、無酶水、SDS、APS、TEMED等購(gòu)于生工生物工程股份有限公司。

1.3主要儀器冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)、PCR儀(Bio-Rad Laboratories)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、凝膠成像儀(Bio-Rad Laboratories)、電熱恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)、pH儀(METTLER TOLEDO)、高溫高壓滅菌鍋(天津億諾科學(xué)儀器有限公司)、超凈工作臺(tái)(Airtech)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、蛋白膠電泳儀(ATTO Corpration)、水平搖床(太倉(cāng)市科教器材廠)、7500FAST熒光定量PCR儀(ABI)。

1.4方法

1.4.1觀察米蝦胚胎發(fā)育過程。挑選個(gè)體較大、體質(zhì)健壯、性成熟的米蝦作為親體，將雌雄按比例1∶2混養(yǎng)在同一蝦缸內(nèi)，溫度維持在25 ℃。待雌蝦抱卵后單獨(dú)喂養(yǎng)。抱卵6 h時(shí)，蝦卵在水中進(jìn)行離體培養(yǎng)。用顯微鏡觀察并拍照，記錄米蝦的胚胎發(fā)育進(jìn)程。

1.4.2米蝦RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成。參考TRIzol?Reagent 試劑說明書提取米蝦的總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)其濃度后，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的提取質(zhì)量。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的第一條鏈。選用β-actin內(nèi)參基因(引物為β-actinF、β-actinR，表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)cDNA模板。

表1 試驗(yàn)所用的引物序列

1.4.3bursicon-α和bursicon-β基因表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組提示，設(shè)計(jì)擴(kuò)增bursicon-α、bursicon-β去掉信號(hào)肽后的ORF區(qū)的特異性引物bursicon-αF、bursicon-αR、bursicon-βF、bursicon-βR(表1)。由于后續(xù)試驗(yàn)需要構(gòu)建2個(gè)亞基基因的表達(dá)載體，所以在上游引物的5’端和下游引物的3’端分別引入了BamH I和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的米蝦cDNA為模板，參照ExTaq酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。bursicon-α反應(yīng)條件是94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。bursicon-β的退火溫度是64 ℃，其余與bursicon-α相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒切膠回收純化后和pMD18-T載體連接，構(gòu)建pMD18-T-α、pMD18-T-β克隆載體并轉(zhuǎn)入DH5α中。參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pMD18-T-α、pMD18-T-β以及pET-28a-c(+)質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind Ⅲ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因片段和酶切后的表達(dá)載體?；厥盏钠斡肨4連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-α、pET-28a-β并轉(zhuǎn)入DH5α中。在加有卡那霉素的LB平板上篩選，挑取陽性克隆，并用雙酶切檢測(cè)。最后將陽性克隆菌液送到金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4重組質(zhì)粒pET-28a-α、pET-28a-β表達(dá)條件的優(yōu)化。將測(cè)序正確的pET-28a-α或pET-28a-β重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta表達(dá)菌中。分別接這2種表達(dá)菌80 μL到6 mL的LB培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中加有卡那霉素和壯觀霉素)過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、220 r/min。次日復(fù)搖菌液到50 mL的培養(yǎng)基中,當(dāng)OD值是0.6時(shí)，取1 mL菌液作為對(duì)照，之后加入IPTG誘導(dǎo)菌液表達(dá)。誘導(dǎo)條件選用16 ℃、150 r/min，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，分別取誘導(dǎo)3、8和24 h菌液各1 mL。誘導(dǎo)條件選用37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，分別取誘導(dǎo)1、2、3、4、5和6 h的菌液各1 mL。將取到的菌液分別離心收集菌體，SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5重組蛋白Bursα和Bursβ的大量誘導(dǎo)與純化。將含有pET-28a-α或pET-28a-β重組質(zhì)粒的Rosetta表達(dá)菌分別接入到600 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、220 r/min。當(dāng)OD值為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG并在37 ℃下誘導(dǎo)，6 h后4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體。菌體在破碎緩沖液BufferA中用超聲波破碎，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清。沉淀用洗滌緩沖液BufferB去除雜蛋白后溶解在含8 mol/L尿素的Wash I里。BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。由于鎳柱可以與目的蛋白上的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽特異性結(jié)合，所以選用Ni-NTA純化目的蛋白，用洗脫緩沖液(咪唑的濃度為500 mmol/L)洗脫親和柱，收集洗脫峰液。對(duì)純化后的Bursα和Bursβ進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.6定量PCR分析米蝦鞣化激素在不同組織中的表達(dá)。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組提示設(shè)計(jì)了bursicon-α和bursicon-β的定量PCR引物bursicon-αQPCR F、bursicon-αQPCR R、bursicon-βQPCR F、bursicon-βQPCR R(表1)。分別提取米蝦眼柄、心、胸神經(jīng)節(jié)和腹神經(jīng)節(jié)組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(方法同“1.4.2”)。分別以4個(gè)組織的cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)bursicon-α和bursicon-β在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因選用β-actin。每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，用軟件SPSS17.0分析表達(dá)差異，最后用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1米蝦的胚胎發(fā)育過程將雌蝦剛剛開始抱卵時(shí)計(jì)為0 h，整個(gè)胚胎發(fā)育階段包括卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、復(fù)眼色素形成期以及蚤狀幼體期共7個(gè)時(shí)期(圖1)。在水溫約26 ℃時(shí)胚胎發(fā)育經(jīng)歷大約19 d。

2.2米蝦Bursα和Bursβ重組蛋白的表達(dá)

2.2.1表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-α、pET-28a-β的構(gòu)建及鑒定。將bursicon-α和bursicon-β編碼信號(hào)肽的核酸序列去掉后，序列片段大小分別為363、348 bp。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-α、pET-28a-β用BamH I和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果α和β目的片段的大小符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果(圖2)。表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后與轉(zhuǎn)錄組中2個(gè)亞基的核苷酸序列在BioEdit軟件中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列沒有產(chǎn)生突變，說明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：1.卵裂期；2.囊胚期；3.原腸期；4.前無節(jié)幼體期；5.后無節(jié)幼體期；6.復(fù)眼色素形成期；7.蚤狀幼體期；8.米蝦幼體Note:1.cleavagestage; 2.blastula; 3.gastrula; 4.egg-nauplius stage; 5.egg-metanauplius stage; 6.embryo with eye pigments formed stage; 7.prehatching stage; 8.the larvae of Caridina圖1 米蝦胚胎發(fā)育過程Fig.1 The process of embryo development in Caridina

注：M.DL2000標(biāo)記；1.pET-28a-α重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2.pET-28a-β重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物Note:M.DL2000 Marker;1.double enzyme products of pET-28a-α recombinant plasmid; 2.double enzyme products of pET-28a-β recombinant plasmid圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombined plasmid by restriction enzyme

2.2.2重組蛋白Bursα、Bursβ表達(dá)條件的篩選。為了促使bursicon-α和bursicon-β在Rosetta菌中的表達(dá)，對(duì)IPTG的濃度、溫度等各種原核表達(dá)的條件進(jìn)行了探討。α亞基去掉信號(hào)肽后蛋白的相對(duì)分子量大小約13.15 kD，加上表達(dá)載體pET-28a-c(+)上的His標(biāo)簽蛋白后，重組Bursα蛋白的相對(duì)分子量大小約16.70 kD；β亞基去掉信號(hào)肽后蛋白的相對(duì)分子量大小約12.70 kD，加上表達(dá)載體pET-28a-c(+)上的His標(biāo)簽蛋白后，重組Bursβ蛋白的相對(duì)分子量大小約16.24 kD。SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)誘導(dǎo)條件為16 ℃、150 r/min，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，pET-28a-α在誘導(dǎo)24 h后依然只有少量表達(dá)，pET-28a-β基本沒有表達(dá)(圖3)；當(dāng)誘導(dǎo)條件為37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，pET-28a-α和pET-28a-β表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而逐漸增多(圖4)。

2.2.3重組蛋白Bursα、Bursβ大量表達(dá)及純化。比較不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，選用在220 r/min、37 ℃，IPTG終濃度為1 mmol/L的條件下，大量誘導(dǎo)表達(dá)Bursα和Bursβ。SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示bursicon-α以包涵體的形式大量表達(dá)，而bursicon-β則可以在上清中表達(dá)，形成可溶性蛋白(圖5)。目的蛋白經(jīng)Ni SephroseTM 6 Fast Flow純化后，SDS-PAGE電泳顯示，在10～25 kD間有一條單一的蛋白條帶，和預(yù)期大小基本相同。結(jié)果說明獲得了較純的Bursα和Bursβ重組蛋白(圖6)。

注：A為α亞基蛋白，M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～4.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、3、8、24 h的α亞基菌體蛋白；B為β亞基蛋白，M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～4.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、3、8、24 h的β亞基菌體蛋白Note:A was Bursα,M.protein molecular weight marker (kD),1-4.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector induced at 0,3,8 and 24 h respectively;B was Bursβ,M.protein molecular weight marker (kD),1-4.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector induced at 0,3,8 and 24 h respectively圖3 在16 ℃條件下Bursα和Bursβ重組蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions at 16 ℃

注：A.α亞基蛋白,M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～7.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、6 h的α亞基菌體蛋白；B.β亞基蛋白,M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～7.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、6 h的β亞基菌體蛋白Note:A.Bursα,M.protein molecular weight marker (kD),1-7.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector induced at 0,1,2,3,4,5 and 6 h respectively;B.Bursβ,M.protein molecular weight marker (kD),1-7.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector induced at 0,1,2,3,4,5 and 6 h respectively圖4 在37 ℃條件下Bursα和Bursβ重組蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions at 37 ℃

2.2.4鞣化激素在不同組織中表達(dá)的差異。以米蝦眼柄、心、胸神經(jīng)節(jié)和腹神經(jīng)節(jié)4種組織的cDNA為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鞣化激素2個(gè)亞基基因bursicon-α和bursicon-β的表達(dá)情況。結(jié)果表明，bursicon-α和bursicon-β均在腹神經(jīng)節(jié)中的相對(duì)表達(dá)量較高，胸神經(jīng)節(jié)次之，眼柄和心中的相對(duì)表達(dá)量均較低(圖7)。

3 結(jié)論與討論

米蝦生活在淡水中，對(duì)水溫和pH的適應(yīng)范圍較廣。但是觀察發(fā)現(xiàn)在水溫較低時(shí)，米蝦的生殖腺發(fā)育緩慢，所以溫度的高低可能對(duì)生殖腺的發(fā)育有一定的影響。此外，對(duì)米蝦的胚胎發(fā)育研究表明，胚胎發(fā)育所需要的時(shí)間也與水溫密切相關(guān)。當(dāng)水溫維持在26 ℃左右時(shí)，米蝦整個(gè)胚胎發(fā)育過程的時(shí)間較短，僅需約19 d。該溫度可能是米蝦生長(zhǎng)的最適溫度。因?yàn)槊孜r個(gè)體小、繁殖快、易飼養(yǎng)，所以適合作為試驗(yàn)材料。

筆者以米蝦為研究對(duì)象，利用BamH I和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，成功構(gòu)建了鞣化激素2個(gè)亞基基因的表達(dá)載體pET-28a-α和pET-28a-β。將表達(dá)載體導(dǎo)入Rosetta表達(dá)菌中后，通過對(duì)表達(dá)條件的篩選發(fā)現(xiàn)在37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，能夠大量表達(dá)Bursα和Bursβ蛋白。An等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅體中鞣化激素2個(gè)亞基基因蛋白大約為15 kD。將重組BURS和PBURS蛋白分別注射到頸部結(jié)扎的黑腹果蠅體內(nèi)會(huì)對(duì)一些免疫相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。在甲殼綱的藍(lán)蟹(Callinectessapidus)中鞣化激素2個(gè)亞基基因蛋白也大約為15 kD。取其處于蛻皮后期D2期和蛻皮期E期時(shí)新形成的角質(zhì)層，然后用表達(dá)獲得的鞣化激素蛋白去進(jìn)行孵育。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比角質(zhì)層明顯增厚，表明鞣化激素參與角質(zhì)層的硬化。在該試驗(yàn)中將原核表達(dá)獲得的Bursα和Bursβ重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示Bursα和Bursβ重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為16.70 kD和16.24 kD，與果蠅和藍(lán)蟹中鞣化激素亞基的分子量大小相近，而且表達(dá)純化后的Bursα和Bursβ蛋白為下一步研究鞣化激素對(duì)角質(zhì)層及免疫系統(tǒng)的作用打下了基礎(chǔ)。

注：M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～5.導(dǎo)入pET-28a-α質(zhì)粒的菌體蛋白(1～2.BufferA，3.BufferB，4～5.Wash I)；6～11.導(dǎo)入pET-28a-β質(zhì)粒的菌體蛋白(6～7.BufferA，8～9.BufferB，10～11.Wash I)Note:M.protein molecular weight marker (kD),1-5.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector(1-2.BufferA，3.BufferB，4-5.Wash I); 6-11.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector (6-7.BufferA，8-9.BufferB，10-11.Wash I)圖5 Bursα和Bursβ重組蛋白純化前SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions before purification

注：M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.α亞基蛋白；2.β亞基蛋白Note:M.protein molecular weight marker (kD); 1.Bursα; 2.Bursβ圖6 Bursα和Bursβ重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions after purification

注：ES.眼柄；HT.心；TG.胸神經(jīng)節(jié)；AG.腹神經(jīng)。不同小寫字母表示組內(nèi)存在顯著性差異(P<0.05)Note：ES.Eyestalk；HT.Heart；TG.Thoracic ganglia；AG.Abdominal ganglia.Different lowercase letters indicate statistically significant differences within the group圖7 米蝦bursicon-α和bursicon-β在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression levels of bursicon-α and bursicon-β in different tissues from Caridina

美洲大蠊(Periplanetaamericana)胸部和腹部神經(jīng)系統(tǒng)可以合成甲殼動(dòng)物心臟激活肽(CCAP)和鞣化激素。在煙草天蛾(Manducasexta)中也發(fā)現(xiàn)胸部和腹部的神經(jīng)節(jié)以及食管下神經(jīng)節(jié)的唇部和上頜部神經(jīng)節(jié)均能表達(dá)CCAP和鞣化激素。其中在煙草天蛾的幼蟲階段只有腹部神經(jīng)節(jié)第一節(jié)表達(dá)鞣化激素，然而到了蛹期，腹部各個(gè)神經(jīng)節(jié)都能表達(dá)鞣化激素。同樣在黑腹果蠅中也有類似的情況，處于幼蟲階段時(shí)腹部神經(jīng)節(jié)只有前4節(jié)表達(dá)鞣化激素，在蛹期時(shí)腹部神經(jīng)節(jié)中表達(dá)鞣化激素的有14個(gè)細(xì)胞。此外在歐洲龍蝦(Homarusgammarus)、藍(lán)蟹以及斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)等甲殼動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)鞣化激素主要是在胸腹神經(jīng)節(jié)中合成。而在該試驗(yàn)物種米蝦中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)米蝦不同組織中鞣化激素的表達(dá)量，結(jié)果表明鞣化激素主要在腹神經(jīng)節(jié)中表達(dá)，在胸神經(jīng)節(jié)中也有一定的表達(dá)量。這與在果蠅及其他蝦蟹類中的研究是一致的。由于鞣化激素是分泌蛋白，猜測(cè)鞣化激素可能由胸腹神經(jīng)節(jié)分泌到血淋巴中發(fā)揮作用。

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