吳少芳

(天門市第一人民醫(yī)院手術(shù)室，湖北 天門 431700)

腹主動脈瘤[1](abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種主動脈擴張性疾病，隨著主動脈擴張程度的增加，動脈破裂的風(fēng)險顯著升高，該病也是一種潛在的致死性疾病。臨床調(diào)查顯示[2]65歲以上人群AAA發(fā)生率為2.4%～10.1%，且隨著病情的進(jìn)展，動脈逐漸擴張并最終破裂；若不進(jìn)行處理，病死率高達(dá)90%。本研究檢測AAA組織原纖維蛋白-1(Fibrillin-1,FBN1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析FBN1與患者生存預(yù)后的關(guān)系，旨在為AAA的發(fā)病及預(yù)后評價提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)天門市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選擇2009年5月至2012年5月在天門市第一人民醫(yī)院心血管外科行手術(shù)治療的45例AAA患者作為AAA組，男28例，女17例，年齡45～69歲，平均(58.9±4.8)歲；動脈瘤直徑4.5～12.5 cm，平均(7.4±1.1) cm。另選擇同期在醫(yī)院行腘動脈人工血管旁路移植術(shù)或腹動脈-股動脈移植術(shù)的29例患者作為對照組，男19例，女10例，年齡51～73歲，平均(59.1±5.2)歲。兩組患者術(shù)前均未接受特殊治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實；患者及近親屬同意，并簽署知情同意書。兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2 試劑與儀器

TRIzol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司，免疫組化試劑盒購自瑞士羅氏公司，免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、PBS緩沖液購自上海拜力生物科技有限公司，通用型ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司，PVDF膜、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人FBN-1單克隆抗體、兔抗人MMP9單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG二抗購自美國購自Sigma公司。Real-time PCR儀購自瑞士Roche公司，采用Pharmacia Biotech公司圖像分析系統(tǒng)，YS100普通光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1樣本采集 AAA組術(shù)中取少量腹主動脈瘤前壁組織，對照組取少量腹前動脈血管吻合處動脈壁組織，將取出的樣本組織采用4%多聚甲醛固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm的連續(xù)切片，置于-80 ℃保存待檢。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色 按照免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行染色，采用二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，PBS沖洗3次，加入濃度為3%的過氧化氫甲醇液以消除內(nèi)源性過氧化酶，再加入3%山羊血清封閉液。依次加入FBN1單克隆抗體、MMP9單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育50 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、封片。隨機選擇5個400倍視野進(jìn)行觀察，計算陽性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)百分比。染色評分同時參考陽性細(xì)胞染色強度和數(shù)量，陽性細(xì)胞染色：無陽性細(xì)胞代表0分，0<陽性細(xì)胞≤25%代表1分，25%<陽性細(xì)胞≤50%代表2分，50%<陽性細(xì)胞≤75%代表3分，陽性細(xì)胞>75%代表4分。根據(jù)染色強度評分：無染色代表0分，輕度染色代表1分，中度染色代表2分，重度染色代表3分。染色強度×陽性細(xì)胞所占百分比作為總分，總分≤3分代表陰性，>3分代表陽性。

1.3.3蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot) 取50 g組織樣本，手術(shù)剪充分剪碎，將組織加入蛋白提取液，打成勻漿，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜，15 000 r·min-1離心50 min，提取上清液，加入BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠，每個泳道加入30 μg總蛋白上樣，常規(guī)方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再加入5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入FBN1單克隆抗體、MMP9單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體，4 ℃封閉過夜。PBS充分洗滌，再加入1∶5 000稀釋的二抗37 ℃孵育2 h。PBS沖洗后加入按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目的條帶的光密度值(OD值)。

1.3.4實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time,RT-PCR) 采用TRIzol RNA提取試劑盒從組織中提取總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA濃度。取1 μg總RNA，按照GeneAmp PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；合成體系：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液3 μL，RNA逆轉(zhuǎn)錄模板1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，上、下游引物各1 μL，加入雙蒸水補充至總反應(yīng)體系為20 μL，37℃金屬浴反應(yīng)50 min合成cDNA。將cDNA置于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增，引物委托金斯瑞生物科技有限公司合成(見表2)。PCR反應(yīng)體系：PCR試劑混合液12.5 μL，DEPC 8 μL，cDNA 2.5 μL，上下游引物1 μL，總反應(yīng)體系25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)后72 ℃ 5 min，溶解曲線條件為55～95 ℃，將PCR產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠電泳分離擴增片段，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行校正，分析目的基因相對表達(dá)量。

表2 引物序列及擴增片段長度

1.4 隨訪

對45例AAA患者進(jìn)行電話或門診隨訪，隨訪從術(shù)后第2天開始，生存分析的截尾數(shù)據(jù)為主動脈瘤原因之外的死亡或失訪，完全數(shù)據(jù)為隨訪時間內(nèi)主動脈瘤相關(guān)死亡，截止日期為隨訪結(jié)束或患者死亡、失訪之日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 主動脈瘤組織和正常動脈壁組織正常FBN1、MMP9蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)BN1、MMP9主要表達(dá)于動脈瘤組織巨噬細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，F(xiàn)BN1、MMP9呈陽性表達(dá)時，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核可見大量藍(lán)色或深藍(lán)色顆粒；主動脈瘤組織FBN1、MMP9蛋白陽性表達(dá)率均高于正常動脈壁組織(P<0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3，圖1。

表3 主動脈瘤組織和正常動脈壁組織FBN1、MMP9蛋白表達(dá)/例(%)

2.2 主動脈瘤組織和正常動脈壁組織FBN1、MMP9 mRNA表達(dá)水平

RT-PCR試驗顯示：主動脈瘤組織FBN1、MMP9 mRNA相對表達(dá)量分別為(1.89±0.19)和(2.29±0.31)，正常動脈壁組織分別為(0.79±0.15)和(1.32±0.12)，主動脈瘤組織FBN1、MMP9 mRNA相對表達(dá)量高于正常動脈壁組織(t=26.317,t=16.061,P<0.001.)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

注：1.主動脈瘤組織;2.正常動脈壁組織。

圖2主動脈瘤組織和正常動脈壁組織FBN1、MMP9mRNA表達(dá)水平

2.3 主動脈瘤組織和正常動脈壁組織FBN1、MMP9蛋白表達(dá)水平

Western Blot檢查顯示：主動脈瘤組織FBN1、MMP9蛋白表達(dá)量分別為(1.08±0.11)和(1.02±0.10)，正常動脈壁組織分別為(0.29±0.06)和(0.39±0.07)，主動脈瘤組織FBN1、MMP9蛋白表達(dá)量高于正常動脈壁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=35.376,t=19.548,P<0.001)，見圖3。

2.4 FBN1、MMP9 在AAA組和對照組組織中表達(dá)的相關(guān)性

對照組中，F(xiàn)BN1與MMP9表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.061,P=0.782)，AAA組中，F(xiàn)BN1與MMP9表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.861,P<0.05)，見圖4。

注：1.主動脈瘤組織;2.正常動脈壁組織。

圖3主動脈瘤組織和正常動脈壁組織FBN1、MMP9蛋白表達(dá)水平

2.5 主動脈瘤組織FBN1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

主動脈瘤組織FBN1表達(dá)水平與年齡、性別、抽煙史、糖尿病、高血壓、冠心病等未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，主動脈瘤破裂及瘤體直徑>8.0 cm患者FBN1表達(dá)水平顯著高于瘤體直徑≤8.0 cm者(P<0.05)，見表4。

2.6 主動脈瘤組織FBN1表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

本研究隨訪至2016年6月30日，隨訪37～70個月，中位隨訪時間49.6個月。生存曲線分析顯示，F(xiàn)BN1陰性患者5年生存率為87.2%(95%CI：54.0%～72.2%)，F(xiàn)BN1陽性患者5年生存率僅為48.1%(95%CI：31.2%～56.7%)。兩組生存資料經(jīng)Log-Rank檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

目前對于AAA的發(fā)病機制依然不清楚，研究證實[3-4]動脈壁膠原纖維和彈力纖維含量降低是其病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為動脈壁MMP表達(dá)異常。張宇等[5]報道稱MMP9過表達(dá)能夠抑制膠原纖維蛋白原合成，導(dǎo)致主動脈中層膠原組織含量減少，最終誘導(dǎo)動脈瘤發(fā)生。FBN1是構(gòu)成微纖維結(jié)構(gòu)的主要糖蛋白，亦是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)[6]FBN1突變能夠影響MMP9的表達(dá)，并引起結(jié)締組織結(jié)構(gòu)、功能異常。龍瀏城等[7]報道稱FBN1基因多態(tài)性可能是中國漢族人群主動脈綜合征遺傳易感因素之一。研究證實[8]，膠原和彈力蛋白等動脈壁細(xì)胞外基質(zhì)成分改變是導(dǎo)致AAA發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)。在動脈瘤形成過程中，大量血栓會附著血管壁，加之血管壁本身存在的粥樣硬化，最終誘發(fā)動脈瘤[9]。呂民等[10]報道稱動脈壁彈力膜發(fā)生改變，導(dǎo)致血管壁無法耐受收縮壓期高血管壓力，而導(dǎo)致動脈擴張，至疾病后期隨著血管壁不斷硬化，甚至出現(xiàn)破裂風(fēng)險。MMP9在主動脈瘤的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，MMP9過表達(dá)能夠降解動脈壁中層膠原和彈力蛋白，從而誘發(fā)AAA。國外研究稱[11]炎性細(xì)胞浸潤是MMP9過表達(dá)的啟動因子，隨著過表達(dá)的MMP9降解彈力蛋白，其降解產(chǎn)物又會進(jìn)一步趨化白細(xì)胞，導(dǎo)致局部組織炎性浸潤，最終促進(jìn)AAA形成和破裂。本研究顯示MMP9在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，提示巨噬細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)可能與AAA的發(fā)生有關(guān)。張蓉等[12]證實AAA血管壁MMP9表達(dá)顯著升高，其參與的慢性炎性反應(yīng)能夠介導(dǎo)血管重塑病理過程。

表4 主動脈瘤組織FBN1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

注：表中無χ2值的為精確概率檢驗。

圖5 FBN1陽性、陰性表達(dá)主動脈瘤患者生存曲線

FBN1是細(xì)胞外基質(zhì)微纖維的主要組成成分，體外實驗證實[13]細(xì)胞及結(jié)締組織彈力纖維外周分布大量的FBN1。FBN1表達(dá)異常所引起的血管中層膜彈力網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)缺損被認(rèn)為是血管疾病的主要誘因。羅明堯等[14]報道稱馬方綜合征是一種FBN1基因突變所引起的遺傳性疾病，患者組織FBN1表達(dá)異常。由于馬方綜合征常伴有升主動脈瘤的形成，因此有學(xué)者認(rèn)為[15]FBN1可能與主動脈瘤的發(fā)生有關(guān)。郭俊等[16]報道稱腹主動脈瘤的發(fā)生與馬方綜合征的致病基因FBN1基因相關(guān)，動脈血管壁FBN1表達(dá)上調(diào)，能夠增加血管壁的硬度和降低血管彈性。此外FBN1除了增加細(xì)胞外基質(zhì)蓄積外，還能增加平滑肌組織的厚度，促進(jìn)主動脈瘤增大。本研究亦證實，F(xiàn)BN1主要表達(dá)于動脈瘤組織巨噬細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，提示FBN1可能增加了動脈壁的厚度，進(jìn)而誘發(fā)AAA形成。進(jìn)一步分析顯示，主動脈瘤組織FBN1、MMP9蛋白及mRNA相對表達(dá)量顯著高于正常動脈壁組織，說明FBN1、MMP9與AAA發(fā)病有關(guān)，兩者可以作為診斷和預(yù)測AAA的潛在指標(biāo)之一。

本研究在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)AAA組FBN1與MMP9表達(dá)呈明顯正相關(guān)；有研究稱[17]慢性炎性反應(yīng)會誘導(dǎo)局部結(jié)締組織、血管組織FBN1異常表達(dá)，這種表達(dá)水平的改變也許正是調(diào)控MMP9表達(dá)信號途徑。在接下來的研究中，我們會進(jìn)一步分析FBN1與MMP9之間的調(diào)控機制，以更好的解釋兩者在AAA之間的聯(lián)系。另外本研究發(fā)現(xiàn)主動脈瘤破裂及直徑>8.0 cm患者FBN1表達(dá)水平顯著高于瘤體直徑≤8.0 cm者。AAA的瘤徑增加，其病理基礎(chǔ)為動脈壁彈性降低、硬度增加，這與FBN1促進(jìn)局部纖維組織增生、MMP9降解膠原蛋白一致。隨著瘤徑的增加導(dǎo)致動脈壁壓力增加，最終引起主動脈瘤破裂。劉杰等[18]亦報道稱AAA的瘤體直徑增加會增加腦血管病的發(fā)生風(fēng)險，對于行手術(shù)治療的AAA患者，術(shù)中處理需要給予足夠重視。在生存結(jié)局方面，F(xiàn)BN1陰性組5年生存率顯著高于陽性組，說明FBN1高表達(dá)是影響患者生存率的獨立危險因素，術(shù)中檢測組織FBN1表達(dá)能夠為預(yù)測患者生存結(jié)局提供參考。

綜上所述，腹主動脈瘤組織FBN1表達(dá)顯著升高，F(xiàn)BN1表達(dá)越高，患者生存率越低，F(xiàn)BN1可以作為AAA患者生存結(jié)局的評估指標(biāo)之一。然而需要注意的是，由于病例數(shù)的限制，本研究所納入的AAA組和對照組病例數(shù)偏少，可能會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚。接下來我們將繼續(xù)增加病例數(shù)，以驗證本研究結(jié)果。

(本文圖1見插圖5-1)

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