王艷華，楚建杰，李子敏，胡娜平，李會(huì)會(huì)，鄭建民，張彩勤，師長(zhǎng)宏， 楊志福，奚苗苗，文愛東，翁 琰

(西京醫(yī)院 1.藥劑科、2.放射科；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，陜西 西安 710032)

腦膠質(zhì)瘤是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的一種最常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35%～61%。目前，雖然有手術(shù)、放療、化療、基因治療及綜合治療等多種治療方法，但因其侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、位置特殊、預(yù)后差，具有很高的病死率和致殘率，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。腫瘤細(xì)胞所處的微生態(tài)環(huán)境是其生長(zhǎng)不容忽視的重要因素[2]，建立一個(gè)可靠的能模擬人腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境以及生物學(xué)特性的動(dòng)物模型，是進(jìn)一步了解和研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制及治療方法的基礎(chǔ)和前提。雖然異位(如皮下接種)移植簡(jiǎn)單方便，易于觀察，但越來越多的資料表明異位移植瘤并非長(zhǎng)在腦內(nèi)，因此與原位移植瘤在血管生成、浸潤(rùn)性、轉(zhuǎn)移性、瘤細(xì)胞生物活性物質(zhì)的表達(dá)、瘤組織微環(huán)境滲透壓等許多生物學(xué)行為上存在明顯差異[3-4]。腫瘤的原位移植動(dòng)物模型與臨床腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生情況最為接近，包括腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，從臨床模擬性來說，是目前研究腦膠質(zhì)瘤最為理想、可靠的腫瘤模型[3, 5]。為此，我們應(yīng)用腦立體定位儀，將不同數(shù)量的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG單細(xì)胞懸液接種于免疫缺陷裸鼠的腦內(nèi)右側(cè)尾狀核區(qū)，建立人腦膠質(zhì)瘤原位移植裸鼠模型。采用核磁共振掃描(magnetic resonance imaging, MRI)方法，在不對(duì)裸鼠造成傷害的前提下，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)造模后裸鼠顱內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)結(jié)合HE染色和免疫組化等病理學(xué)檢查分析結(jié)果，確立了造模后成模的最佳時(shí)間。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人腦膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞系由西京醫(yī)院神經(jīng)外科教研室惠贈(zèng)。BALB/c-nu/nu裸鼠24只，♂，6～8周齡，清潔級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：FCXK(滬)2003-0003，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(軍)2012-0023]。裸鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、A組、B組、C組，每組6只。A、B、C組接種細(xì)胞數(shù)分別為1.5×105個(gè)、2.0×105個(gè)、2.5×105個(gè)(懸浮于無血清DMEM培養(yǎng)液)，分別在接種后7、14、21、28 d對(duì)每組裸鼠進(jìn)行核磁共振掃描，并在28 d時(shí)取對(duì)照組鼠1只、造模組每組1只(共3只)裸鼠行4%多聚甲醛心內(nèi)灌注并固定，對(duì)獲取的全腦標(biāo)本進(jìn)行切片，并進(jìn)行病理學(xué)觀察，取其心、肝、脾、肺、腎、脊髓等主要臟器，檢查有無轉(zhuǎn)移灶，剩余裸鼠正常飼養(yǎng)，觀察生存期。

1.2試劑胎牛血清(西安沃德生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)粉(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；釓噴酸葡胺注射液(廣州康臣藥業(yè)有限公司)；兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)、S-100蛋白多克隆抗體、SABC試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3儀器SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；QP-160型二氧化碳培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；ALC-H型動(dòng)物腦立體定向儀、ALC-IP600型微量注射泵、ALC-CED9型動(dòng)物顱骨鉆(北京吉安得爾科技有限公司)；3.0T MAGNETOM Trio Tim核磁共振成像系統(tǒng)(德國(guó)西門子公司)；3T老鼠線圈(上海辰光醫(yī)療科技有限公司)； Olympus IX71倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG分裝于數(shù)只底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶中，按常規(guī)方法培養(yǎng)，即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，Hanks液洗2次后制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)至各種所需細(xì)胞濃度的懸液用于接種。

1.4.2腦內(nèi)原位接種 整個(gè)接種過程在層流超凈臺(tái)進(jìn)行，接種部位為裸鼠右側(cè)大腦尾狀核。裸鼠經(jīng)0.8%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(20 mL·kg-1)，俯臥位將其頭部固定在腦立體定向儀上。75%乙醇消毒頭頂部皮膚后，先于顱中線處眼裂后開1個(gè)垂直切口，暴露前囟。接種部位的確定參照文獻(xiàn)[6]，取前囟中點(diǎn)前l(fā) mm、矢狀縫向右旁開2.5 mm處，用直徑為1 mm的動(dòng)物顱骨鉆小心鉆穿顱骨，然后用吸有5 μL瘤細(xì)胞懸液的微量進(jìn)樣器經(jīng)孔垂直進(jìn)入腦白質(zhì)區(qū)中，進(jìn)針深度為針尖距顱骨表面3.5 mm，注射前將針稍微退回約0.5 mm，以0.5 μL·min-1注射速度將瘤細(xì)胞懸液緩慢注入，除針前停留2 min后再緩慢拔針，用骨蠟封閉骨孔，生理鹽水沖洗術(shù)野，縫合頭皮，最后用碘酒消毒。正常對(duì)照組接種時(shí)以同體積Hanks液替代。術(shù)后先將裸鼠置于37℃恒溫板上保溫，待蘇醒后再放回籠中，術(shù)后無需抗感染治療。每天觀察其生活狀態(tài)，包括精神、飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量等情況。

1.4.3MRI檢測(cè) 裸鼠經(jīng)0.8%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，按1 mmol·kg-1的劑量靜脈注入釓噴酸葡胺注射液，置于3T老鼠線圈中，采用3.0T MAGNETOM Trio Tim核磁共振成像系統(tǒng)對(duì)裸鼠頭部橫斷面、冠狀面、矢狀面分別行T1加權(quán)快速自旋回波序列(TSE)增強(qiáng)掃描。具體參數(shù)為：橫斷面層厚0.8 mm，間隔0.2 mm，F(xiàn)OV 39 mm×50 mm，矩陣296×384，TR/TE=1 130 ms/15 ms；冠狀面層厚1.0 mm，間隔0.2 mm，F(xiàn)OV 39 mm×50 mm，矩陣296×384，TR/TE=1 130 ms/15 ms；矢狀面層厚1.0 mm，間隔0.2 mm，F(xiàn)OV 31 mm×40 mm，矩陣296×384，TR/TE=1 000 ms/17 ms。觀察裸鼠腦內(nèi)移植瘤成像情況及位置，并用自帶軟件測(cè)量腫瘤的最大前后、左右和上下徑，計(jì)算不同瘤齡的腫瘤體積(mm3)=前后徑×左右徑×上下徑[7]。

1.4.4腦組織心內(nèi)灌注固定 將裸鼠麻醉，直接開胸，在右心耳處用針扎出1個(gè)小孔，用裝有肝素的輸液器在左心室進(jìn)行穿刺，緩慢灌注用生理鹽水稀釋的肝素鈉(20 IU·mL-1)10 mL，剛開始裸鼠劇烈抽動(dòng)，待流出液不再有血時(shí)，改為4%多聚甲醛灌注，待裸鼠兩前肢及兩肺變白，后肢繃直，尾部豎起成一直線時(shí)表明灌注成功。此時(shí)腦組織白而硬。用彎鑷小心取出灌注后的腦組織，置4%甲醛溶液中過夜固定。

1.4.5病理形態(tài)學(xué)及免疫組化檢查 將獲取的全腦標(biāo)本按裸鼠腦表面的接種穿刺點(diǎn)做橫斷面取材，脫水，石蠟包埋，厚1 μm切片，行以下檢查：① 常規(guī)HE染色，光鏡下觀察；② 免疫組化檢查。用SABC法觀察GFAP及S-100蛋白表達(dá)情況。所有的標(biāo)本均采用免疫組化ABC法進(jìn)行染色。陰性對(duì)照切片的染色以PBS代替一抗，其余的步驟和方法與陽性對(duì)照切片相同。陽性強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)是以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺棕色細(xì)顆粒為弱陽性，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)深棕色粗顆粒為強(qiáng)陽性，中度陽性則介于二者之間。

2 結(jié)果

2.1荷瘤裸鼠一般狀況本實(shí)驗(yàn)接種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的18只裸鼠接種后全部存活，且穿刺點(diǎn)無出血感染，也未出現(xiàn)手術(shù)損傷神經(jīng)的癥狀。實(shí)驗(yàn)組自接種后2 d起逐漸恢復(fù)正常覓食、飲水；接種后7 d，B、C組肉眼可見小瘤結(jié)節(jié)，生存狀態(tài)良好，體質(zhì)量上升。各組裸鼠生活狀態(tài)見Tab 1。

Tab 1 The living condition of rats

2.2裸鼠的生存時(shí)間對(duì)照組裸鼠一直存活。3組接種U87-MG的裸鼠中，A組裸鼠最長(zhǎng)活到了50 d，平均生存時(shí)間(46.50±3.27) d；B組裸鼠最長(zhǎng)活到了42 d，平均生存時(shí)間(38.50±3.28) d，A組與B組生存時(shí)間比較差異有顯著性(P<0.05)；C組裸鼠最長(zhǎng)活到了34 d，平均生存時(shí)間(30.67±3.51) d，B組與C組生存時(shí)間比較差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Survival time of nude n=5)

*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B

2.3荷瘤裸鼠的MRI掃描結(jié)果及腫瘤體積各組裸鼠接種7 d時(shí)T1加權(quán)TSE增強(qiáng)掃描發(fā)現(xiàn)，B、C組裸鼠腦內(nèi)有異常信號(hào)，接種14 d與21 d的增強(qiáng)掃描均顯示接種腫瘤顯像清楚，呈高信號(hào)，大小和位置非常明確，同周圍正常腦組織有明顯差異，28 d腫瘤生長(zhǎng)更快，均可準(zhǔn)確測(cè)得其橫斷面、冠狀面和矢狀面3個(gè)方向上的最大徑(Fig 1)。腫瘤呈圓形或類圓形腫塊，腫瘤較大時(shí)其內(nèi)可有壞死和出血信號(hào)，占位效應(yīng)表現(xiàn)為中線結(jié)構(gòu)向?qū)?cè)移位，同側(cè)腦室受壓擴(kuò)大移位。通過公式計(jì)算出腫瘤成像的體積見Tab 3。

Tab 3 Tumour volume of nude n=5)

**P<0.01vsgroup A;##P<0.01vsgroup B

Fig 1 MRI of gliomas in nude mice

2.4病理解剖學(xué)檢查經(jīng)心臟灌注固定的模型組裸鼠腦組織內(nèi)均可見瘤組織形成，移植瘤組織位于右大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，呈圓形或橢圓形浸潤(rùn)生長(zhǎng)，較周圍正常組織顏色深，邊界清晰，周邊腦組織腫脹，瘤體較大時(shí)可見中線向?qū)?cè)移位，切面可見腫瘤內(nèi)出血和壞死。其他臟器未見轉(zhuǎn)移。

2.5移植瘤的HE染色HE染色切片光鏡下可見，造模14 d的裸鼠腫瘤均有膠質(zhì)瘤細(xì)胞和柵欄狀壞死，此為膠質(zhì)瘤的特征。瘤細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和星形，胞核大而圓，核深染，病理性核分裂象多見，偶見雙核，瘤組織內(nèi)有出血和壞死以及豐富的微血管。腫瘤細(xì)胞排列密集，常圍繞小血管呈局灶性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，生長(zhǎng)活躍，排列呈束狀、小團(tuán)塊狀。腫瘤區(qū)染色較周圍正常腦組織深，與正常組織交界處雖能見到腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，但仍能見到一個(gè)較明顯的界線(Fig 2)。

Fig 2 Morphology of gliomas in nude mice (×400)

2.6移植瘤的免疫組化染色GFAP是星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤的特異性表達(dá)蛋白，S-100也是腦腫瘤診斷的免疫學(xué)標(biāo)記蛋白[1]。造模14 d的裸鼠腦內(nèi)移植膠質(zhì)瘤免疫組化染色結(jié)果中，瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈GFAP陽性表達(dá)(Fig 3)，胞質(zhì)/胞核呈S-100陽性表達(dá)(Fig 4)，說明裸鼠從造模14 d開始便形成了有人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤特性的腦腫瘤。

3 討論

本模型制備的結(jié)果受多種因素的影響，為保證造模成功，造模過程要注意：① 保證細(xì)胞活力及接種數(shù)量。保證細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，盡量使細(xì)胞懸液的制備和裸鼠的麻醉、消毒、固定定位同時(shí)進(jìn)行，以保證細(xì)胞懸液在最短時(shí)間內(nèi)接種至裸鼠體內(nèi)。另外，整個(gè)接種過程中要將細(xì)胞懸液置于冰上保存，用時(shí)搖勻，避免細(xì)胞貼壁、堆積，保持濃度均勻。② 選擇合適的接種部位。我們將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG接種于裸鼠右側(cè)大腦尾狀核，坐標(biāo)為前囟中點(diǎn)前 1 mm、矢狀縫向右旁開2.5 mm，深度為硬膜下3 mm。選擇此注射點(diǎn)的目的是保證腫瘤能在該位點(diǎn)的前后、左右、上下方向有足夠的生長(zhǎng)空間，從而保證腫瘤生長(zhǎng)的大小和良好的生長(zhǎng)形態(tài)。采取立體定向儀下準(zhǔn)確的定位，既保證足夠的深度，又防止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入側(cè)腦室。③ 防止腫瘤細(xì)胞沿針道擴(kuò)散。我們采用進(jìn)針3.5 mm、回退0.5 mm的方法，保證足夠的接種空間；0.5 μL·min-1的緩慢注射速度、注射后停針2 min和骨蠟封閉骨孔的方法，防止細(xì)胞懸液外溢，保證準(zhǔn)確的細(xì)胞接種數(shù)量。④ 防止動(dòng)物模型感染。整個(gè)手術(shù)過程在層流超凈臺(tái)進(jìn)行，術(shù)前75%乙醇消毒頭頂部皮膚，術(shù)后碘酒消毒傷口。本實(shí)驗(yàn)建立人腦膠質(zhì)瘤原位移植裸鼠模型的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確定位接種點(diǎn)和嚴(yán)格控制接種量，同時(shí)要特別注意注射和拔針的速度以及停針時(shí)間。只有保證了瘤細(xì)胞的接種位置和接種數(shù)量的一致性，才能確保移植瘤生長(zhǎng)的一致性、穩(wěn)定性和可比性。實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物為免疫缺陷動(dòng)物，飼養(yǎng)環(huán)境要求高，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高。

Fig 3 GFAP protein expression in gliomas of nude mice by immunohistochemical staining (×400)

Fig 4 S-100 protein expression in gliomas of nude mice by immunohistochemical staining(×400)

文獻(xiàn)報(bào)道的人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位移植模型通常采用培養(yǎng)細(xì)胞懸液或腫瘤組織經(jīng)消化后處理成的細(xì)胞懸液顱內(nèi)注射法，其成功率僅為70%[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前人的造模經(jīng)驗(yàn)，借助立體定向儀的輔助，在預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，改進(jìn)并確定了最終造模條件，采用此方法，本研究中18只裸鼠造模后全部成瘤，移植成瘤率100%。說明實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的接種數(shù)量與模型制備的成功率無關(guān)，但實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各組部分時(shí)段腫瘤的體積差異有顯著性，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同研究需要，選擇不同的細(xì)胞接種數(shù)量。腫瘤顱內(nèi)生長(zhǎng)穩(wěn)定，接種后相同時(shí)間腫瘤大小和形態(tài)相似，都表現(xiàn)為類圓形，腫瘤生長(zhǎng)特性及病理特性與人腦膠質(zhì)瘤相似，具有分化程度低、微血管豐富、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)，初期以針道的上下方向生長(zhǎng)明顯，后期則以前上至后下的大腦縱軸方向生長(zhǎng)較為明顯，符合該部位裸鼠腦的解剖學(xué)特征。早期荷瘤裸鼠體質(zhì)量呈輕微的上升趨勢(shì)， A、B和C組裸鼠分別從接種后20 d、17 d和14 d開始體質(zhì)量下降，14 d后腫瘤的體積開始迅速增長(zhǎng)，提示裸鼠體質(zhì)量一旦出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，則意味著腫瘤已生長(zhǎng)進(jìn)入中后期。就生存時(shí)間來說，A組(1.5×105)生存時(shí)間較長(zhǎng)，且和B組(2.0×105)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組(2.5×105)生存時(shí)間較短，這主要是因?yàn)榻臃N細(xì)胞量不同。免疫組化標(biāo)記所有裸鼠腫瘤均有GFAP和S-100蛋白陽性表達(dá)；HE染色可觀察到移植瘤在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)呈高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、無包膜形成、血管豐富、瘤細(xì)胞異型性明顯，均符合星形細(xì)胞來源特點(diǎn)。3組裸鼠均于接種U87-MG細(xì)胞后14 d即可見腦膠質(zhì)瘤形成，隨后腫瘤生長(zhǎng)明顯加快，21 d時(shí)肉眼可見腫瘤的生長(zhǎng)已沖破顱骨而凸顯出來，裸鼠出現(xiàn)偏癱、弓背、激惹、癲癇等神經(jīng)癥狀，28 d后裸鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡，與臨床具有良好的模擬性。根據(jù)本模型的生物學(xué)特性，提示接種后14 d左右為利用此模型的最佳時(shí)期。我們利用此方法造模14 d后的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ烷_展了抗腫瘤藥對(duì)腦膠質(zhì)瘤治療作用的研究，取得的結(jié)果進(jìn)一步證明了該造模方法的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)建立的人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位移植模型造模方法成瘤率高、重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)周期短、移植瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定、顱外遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移率低，誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)符合人腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，可為模擬人腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境，更好地研究人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，探尋各種實(shí)驗(yàn)性治療方法，以及篩選有效的抗膠質(zhì)瘤新藥提供理想的動(dòng)物模型。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心、空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院放射科和藥劑科新藥研發(fā)中心完成。感謝課題組成員提供的大力幫助。)

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