萬 磊，陳青松，周 壯，周翔宇，鄭道峰，吳忠均

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶 400016)

肝臟缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)是指肝臟在缺血一段時間后恢復(fù)血液供應(yīng)，該過程不僅不利于肝功能的恢復(fù)，往往造成更嚴重的肝臟功能障礙。在肝臟IRI進程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、肝細胞的凋亡、壞死等都是引起肝損傷的重要原因[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)作為一種廣泛存在于人類細胞中的III組蛋白去乙?；?，通過其去乙?；饔茫{(diào)控抑癌因子p53、核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子(forkhead-box transcription factor, FOXO)等多種因子，發(fā)揮各種生物活性[2]。NF-κB作為體內(nèi)關(guān)鍵的信號分子，精確調(diào)控炎癥反應(yīng)，而通過SIRT1的效應(yīng)，可以降低其亞單位NF-κB p65的表達，抑制下游炎癥因子的活性[3]。p53在細胞內(nèi)主要表現(xiàn)為阻滯細胞周期、促進細胞凋亡等作用，而SIRT1可以降低p53的結(jié)合能力，減少細胞凋亡[4]。丹酚酸 B(salvianolic acid B, Sal B)是從丹參中提取的高活性、低毒性的水溶性化合物，具有改善心腦血流量、抗氧化、抗炎等生物活性，近年來研究也證明Sal B對心肌梗死有保護作用，且能改善心腦IRI[5]。本研究擬通過建立大鼠肝細胞株BRL-3A的缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型[6]，觀察Sal B是否減輕H/R誘導(dǎo)的肝細胞損傷，并初步探討其潛在機制，為臨床治療肝IRI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與試劑 大鼠BRL-3A肝細胞株購自武漢Procell公司；Sal B購自上海Winherb醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自BI公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒購自南京建成生物公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β (interleukin 1β，IL-1β) ELISA試劑盒購自Neobioscience公司；逆轉(zhuǎn)錄all in one試劑、SYBR熒光染料、CCK-8試劑購自Biotool公司；TRIzol試劑購自TaKaRa公司；引物購自上海生工有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天公司；ECL發(fā)光液購自Advansta公司；兔抗NF-κB p65抗體購自北京中杉金橋生物公司；兔抗SIRT1、p53、Bax、Bcl-2抗體購自沈陽萬類公司；兔抗β-actin抗體及山羊抗兔IgG購自武漢博士德公司。

1.1.2儀器 3131型三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；MSS酶標儀(芬蘭雷勃公司)；Allegra 64R 型超速冷凍離心機(美國Beckman公司)；PowerPac 300型電泳儀、CFX96 型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠BRL-3A肝細胞培養(yǎng)及Sal B藥物配制 將BRL-3A正常培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于普通的培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、95%空氣)中，觀察細胞形態(tài)。將 Sal B溶解在無菌的PBS液中，配成濃度10 μmol·L-1的基礎(chǔ)液，封口避光保存于-20℃冰箱，根據(jù)實驗需要，再用 DMEM/F12培養(yǎng)基將基礎(chǔ)母液稀釋到相應(yīng)的濃度。

1.2.2實驗分組及H/R模型構(gòu)建 實驗分為對照組：正常培養(yǎng)的細胞；對照處理組：正常培養(yǎng)的細胞中加入實驗最適濃度Sal B(0.5 μmol·L-1)干預(yù)；模型組：H/R誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞；實驗處理組：在需要H/R誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞中分別加入0.25、0.5 μmol·L-1Sal B干預(yù)。H/R模型構(gòu)建：正常條件培養(yǎng)肝細胞生長至融合度70%左右后，改用不含血清的饑餓培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱(37℃、94% N2、1% O2、5% CO2)缺氧培養(yǎng)12 h，再置入普通孵箱培養(yǎng)4 h[6]。在缺氧前2 h加入相應(yīng)濃度藥物干預(yù)。

1.2.3CCK-8檢測細胞活力 選取狀態(tài)良好的細胞計數(shù)，然后按1.2×104個/孔接種到2塊96孔板里，隨機將兩板分為對照組和H/R組；對照組設(shè)置空白對照及調(diào)零組，H/R組設(shè)置空白H/R、H/R加藥及調(diào)零組；空白對照組正常孵育，空白H/R組缺氧培養(yǎng)12 h后再復(fù)氧培養(yǎng)4 h，H/R加藥組在不同濃度藥物干預(yù)2 h后再H/R處理，調(diào)零組沒有細胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種完畢后，將孔板放入普通培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h，再按實驗要求藥物干預(yù)，按需行缺氧/復(fù)氧處理，根據(jù)說明書，再混入10 μL CCK-8反應(yīng)液，于正常孵箱中反應(yīng)90 min，測OD值。

1.2.4ELISA檢測TNF-α和IL-1β水平 將細胞接種到2塊6孔板中正常培養(yǎng)，待細胞貼壁融合到70%左右，開始藥物干預(yù)，隨機選擇1塊孔板，設(shè)置空白對照組及加入0.5 μmol·L-1藥物干預(yù)對照組，另一塊孔板設(shè)置空白H/R組和分別加入0.25、0.5 μmol·L-1藥物干預(yù)的H/R組。H/R后收集各組細胞液，按說明書要求檢測TNF-α和IL-1β水平。

1.2.5微板法檢測ALT和AST水平 將細胞接種到2塊6孔板中正常培養(yǎng)，隨機選擇孔板設(shè)置分組，按上述方法處理，收集培養(yǎng)液，按試劑盒要求檢測ALT、AST水平。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用T25培養(yǎng)瓶正常培養(yǎng)細胞，待貼壁融合70%左右開始藥物干預(yù)處理細胞，分為對照組、加0.5 μmol·L-1藥物干預(yù)的對照組、H/R組、加0.25、0.5 μmol·L-1藥物干預(yù)的H/R組。H/R完成后收集上清，與消化的細胞一起離心，PBS多次沖洗，重復(fù)離心步驟，最后收集細胞，按說明操作，檢測凋亡。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 實驗分組和處理方法同上，H/R后提取細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線后，按每孔30 μg計算上樣量。濃縮膠80 V電泳，等蛋白預(yù)染標記物完全分開后，120 V繼續(xù)電泳下層膠；充分分離后，250 mA電轉(zhuǎn)至PVDF膜；膜在環(huán)境溫度下用5%的脫脂牛奶于70 r·min-1的搖床上封閉90 min，再孵育一抗(β-actin、SIRT1、p53、Bax、Bcl-2為1 ∶500，NF-κB p65為1 ∶800)，置于4℃過夜；隔天將膜夾入TBST中，于110 r·min-1搖床上洗3遍，各10 min，再孵育二抗(1 ∶5 000)，置于37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)1 h，之后再將膜用TBST洗3次；最后曝光顯影，用軟件進行蛋白表達量的定量分析。

1.2.8實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 實驗分組和處理方法同上，H/R后用TRIzol法提取各組細胞總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并取cDNA行熒光定量PCR，檢測SIRT1、NF-κB p65、p53、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平，以GADPH作為內(nèi)參，獨立實驗，重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系: cDNA 1 μL、SYBR Green 5 μL、上下游引物各0.2 μL、無酶水3.6 μL。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers for selected genes

2 結(jié)果

2.1SalB對H/R后細胞活力的影響在不同濃度Sal B(0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)預(yù)處理后，對細胞行H/R誘導(dǎo)，通過檢測分析發(fā)現(xiàn)，H/R組與對照組相比，細胞活力明顯下降(P<0.01)；0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 μmol·L-1藥物干預(yù)后的H/R組與H/R組對比，肝細胞活力升高(P<0.05，P<0.01)，5、10 μmol·L-1藥物干預(yù)后的H/R組與H/R組對比，肝細胞活力升高不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且0.5 μmol·L-1Sal B預(yù)處理后肝細胞活力提高最明顯，所以將該濃度作為后續(xù)實驗的藥物最佳預(yù)處理濃度(Fig 1)。

Fig 1 Effect of Sal B on viability of BRL-3A cells induced by H/R

CON: Control group; H/R: Hypoxia 12 h/reoxygenation 4 h.##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsH/R.

2.2SalB降低H/R誘導(dǎo)的肝細胞上清液中ALT和AST水平對照組中ALT、AST水平較低，0.5 μmol·L-1Sal B干預(yù)后的對照組中ALT、AST水平變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。H/R誘導(dǎo)后，細胞培養(yǎng)液中ALT、AST水平明顯上升，預(yù)處理后，H/R中ALT、AST水平降低(P<0.01，F(xiàn)ig 2A)。

2.3SalB降低H/R誘導(dǎo)的肝細胞上清液中TNF-α和IL-1β水平藥物干預(yù)的對照組與空白對照組相比，細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β的分泌變化不明顯，H/R誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組，而藥物干預(yù)降低了H/R組TNF-α、IL-1β的分泌(P<0.01，F(xiàn)ig 2B)。

2.4SalB降低H/R誘導(dǎo)的肝細胞凋亡率與空白對照比較，藥物干預(yù)的對照組凋亡率無明顯變化，而H/R組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與H/R組相比，藥物干預(yù)的H/R組細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見Fig 3。

2.5SalB影響H/R后肝細胞SIRT1、NF-κBp65、p53、Bax、Bcl-2的蛋白表達水平與空白對照相比，H/R組NF-κB p65、p53、Bax蛋白表達上調(diào)，SIRT1、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)；與H/R組相比，Sal B預(yù)處理后的H/R組NF-κB p65、p53、Bax表達下調(diào)，SIRT1、Bcl-2表達增高(P<0.05，P<0.01)，見Fig 4。

2.6SalB影響H/R后肝細胞SIRT1、NF-κBp65、p53、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平如Fig 5所示，與空白對照相比，H/R組NF-κB p65、p53、Bax的mRNA表達水平明顯增高，SIRT1、Bcl-2的mRNA表達水平降低(P<0.01)；與H/R組相比，藥物預(yù)處理后的H/R組NF-κB p65、p53、Bax的mRNA表達水平降低，SIRT1、Bcl-2的mRNA表達水平增高(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

肝IRI作為一個復(fù)雜的病理生理過程，在大型的肝臟手術(shù)中，尤其是肝移植術(shù)中常常是無法避免的。通過了解肝 IRI發(fā)生的機制發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)、肝細胞的凋亡、壞死等都是引起肝損傷的重要原因，因此，控制細胞凋亡和炎癥的發(fā)生可以減輕IRI[7]。Sal B由于其改善血流量、抗炎、抗氧化等功能，已經(jīng)應(yīng)用于大量心腦血管疾病的研究[8]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，Sal B通過調(diào)控TLR4/MyD88/TRAF6信號通路，使NF-κB p65的表達降低，減輕了心臟IRI。Li等[10]發(fā)現(xiàn)，Sal B通過SIRT1作用，降低乙?；痯53表達，從而對抗乙醇性的急性肝損傷。因此，我們推測Sal B也能夠通過減輕炎癥及凋亡，緩解肝臟IRI。研究中我們建立了 BRL-3A的H/R模型模擬肝臟IRI，用各種濃度的Sal B干預(yù)H/R處理的細胞，發(fā)現(xiàn)Sal B 0.5 μmol·L-1時，H/R的肝細胞活力最強，且該濃度能明顯抑制H/R后的細胞凋亡，降低轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT含量，降低 TNF-α、IL-1β分泌，表明Sal B能夠減少炎性反應(yīng)和凋亡來保護 H/R誘導(dǎo)的肝細胞損傷。這與Lv等[11]通過建立大鼠大腦中動脈閉塞手術(shù)模型，驗證Sal B作用時所得結(jié)果是一致的。

Fig 2 Effect of Sal B on levels of ALT, AST, TNF-α and IL-1β in supernatant of BRL-3A cells induced by H/R

A：Expression of ALT and AST was detected by microplate assay; B: Levels of TNF-α and IL-1β were determined by ELISA.CON: Control group; CONS: CON+0.5 μmol·L-1Sal B; H/R: Hypoxia 12 h/reoxygenation 4 h; 0.25: H/R+0.25 μmol·L-1Sal B; 0.5: H/R+0.5 μmol·L-1Sal B.##P<0.01vsCON;**P<0.01vsH/R.

Fig 3 Effect of Sal B on apoptosis in BRL-3A cells induced by H/R

##P<0.01vsCON;**P<0.01vsH/R

Fig 4 Effect of Sal B on relative protein expression in BRL-3A cells induced by H/R

A, C: Expression of relative protein were detected by Western bolt; B, D: Semi-quantitative analysis of expression of relative protein.##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsH/R.

Fig 5 Effect of Sal B on relative mRNA levels in BRL-3A cells induced by H/R

A:mRNA expression levels of SIRT1, NF-κB p65; B: mRNA expression levels of p53, Bax, Bcl-2.##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsH/R.

SIRT1作為一種依靠NAD+的Sirtuin蛋白家族中的重要一員，因為其去乙酰化作用，調(diào)控p53、NF-κB p65等常見的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)和抗凋亡的作用[12]。本實驗研究證實，不管在蛋白還是mRNA層面，與空白對照相比，H/R誘導(dǎo)后，NF-κB p65、p53、Bax表達明顯上調(diào)，SIRT1、Bcl-2表達下調(diào)；而Sal B干預(yù)后，與H/R組相比，NF-κB p65、p53、Bax表達下調(diào)，SIRT1、Bcl-2表達增高。這與Hernández-Jiménez等[13]通過對SIRT1沉默的轉(zhuǎn)基因小鼠腦缺血/再灌注處理后得到的結(jié)果一致。Liu等[14]也證實了在H/R條件下，激活SIRT1能降低Bax、p53等的表達。但本實驗只在體外進行了驗證，未能對相關(guān)通路進行更充分的研究，后續(xù)實驗中我們會加入動物實驗，明確Sal B對IRI更加確切的機制。

綜上，Sal B能保護H/R誘導(dǎo)的肝細胞損傷，其機制可能與SIRT1/NF-κB/p53通路有關(guān)系。

(致謝：本實驗在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗研究中心完成，在此感謝在實驗中給予指導(dǎo)和幫助的各位老師和同學(xué)。)

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