樂(lè) 亮，徐 江，姜保平，許利嘉，胡克平，陳士林，肖培根

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700)

糖尿病腦病是一種糖尿病引起的腦部病變，主要包括糖尿病性酮癥酸中毒昏迷及糖尿病性高滲性非酮癥性昏迷[1]。隨著糖尿病人群的增多，糖尿病腦病也逐漸受到人們的重視。腦血管改變、氧化應(yīng)激、糖基化終末端產(chǎn)物(glycation end products, AGEs)和大腦胰島素信號(hào)系統(tǒng)損傷被認(rèn)為是糖尿病腦病的主要病因[2]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，有毒的α-羰基醛如丙酮醛的腦部聚積是認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵因素[3]。臨床研究也顯示，糖尿病患者血液中丙酮醛水平明顯升高[4]。丙酮醛是一種由糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物，能影響糖和脂代謝[5]。在正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，丙酮醛能通過(guò)谷胱甘肽依賴性乙二醛酶系統(tǒng)降解，而在高血糖及糖代謝受損的條件下，丙酮醛往往累積以致?lián)p傷機(jī)體[6]。過(guò)量的丙酮醛誘導(dǎo)線粒體損傷、增加活性氧的產(chǎn)生[7]。此外，由于大腦的高氧耗，比其他器官更易受到氧化損傷。有研究表明，丙酮醛能通過(guò)線粒體和Fas受體信號(hào)通路誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡[8]。而在線粒體凋亡機(jī)制中，p53基因是一種重要的促凋亡基因，主要調(diào)控兩條凋亡途徑，一是p53基因?qū)ν庠葱缘蛲鐾緩降恼{(diào)節(jié)，如激活死亡受體(death receptor, DR)4、DR5、Fas受體等；另一條是p53內(nèi)源性凋亡途徑的調(diào)控，主要通過(guò)線粒體信號(hào)通路調(diào)節(jié)。

兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.又名雪菊、金雞菊，系菊科(Asteraceae)金雞菊屬(Coreopsis)的干燥頭狀花序?！缎氯A本草綱要》記載，其味甘、性平，具有清熱解毒、化濕止痢的功效。課題組前期探討了兩色金雞菊的7種主要成分——奧卡寧、3’，4’，8-三羥基黃銅-7-O-β-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、黃諾馬苷、馬里苷、豆甾醇、紫鉚因的對(duì)抗HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用[9]。同時(shí)，我們也研究了馬里苷對(duì)抗丙酮醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)馬里苷能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，降低丙酮醛誘導(dǎo)的線粒體損傷[10]。紫鉚因是一種植物來(lái)源的多酚類化合物, 大量存在于紫鉚屬的多種植物中，在雪菊中也具有一定含量的紫鉚因。紫鉚因具有廣泛的生物學(xué)活性, 如抗炎、抗纖維化等。因其具有一定的神經(jīng)毒性, 紫鉚因常用于蝸牛等害蟲的防治。本文探討了紫鉚因?qū)贡┱T導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用及其抗凋亡的機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞株與試劑PC12細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。紫鉚因購(gòu)自美國(guó)ChromaDex公司，純度為94.3%；6-羥基多巴(HY-B1081)、牛血清白蛋白(HY-D0842)、碘化丙啶(propidium iodide，PI, HY-D0815)、Hoechst 33342(HY-15559)均購(gòu)自MedChemExpress公司；乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(C0017)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；馬血清(16050130)、胎牛血清(30044184)、鏈青霉素(15140122)、RMPI 1640(11875176) 培養(yǎng)基均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；p53(ab26)、caspase-9 (ab32539)抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；β-actin(HX1827)購(gòu)自北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AS111-01)購(gòu)自北京全式金生物有限公司。

1.2儀器Infinite 1000 M熒光酶標(biāo)儀(Tecan公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；超凈工作臺(tái)(日本AIRTECH公司)；低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；倒置顯微鏡與照像系統(tǒng)(日本Nikon公司)；DeltaVision高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)(瑞典通用電氣醫(yī)療)；電熱恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞置于含10%馬血清、5%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RMPI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代的PC12 細(xì)胞分別先用2.5、5 μmol·L-1的紫鉚因預(yù)處理1 h，然后加入1.5 mmol·L-1丙酮醛，再置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法檢測(cè)各模型組細(xì)胞存活率細(xì)胞培養(yǎng)及藥物分組同“2.1”，在不同濃度的紫鉚因或丙酮醛處理相應(yīng)的時(shí)間后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，吸干殘留液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床上振搖10 min至生成的藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶完全溶解，置于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)其吸光度值。

2.3LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞壞死PC12細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，取細(xì)胞上清液檢測(cè)LDH釋放值，LDH釋放實(shí)驗(yàn)按照LDH試劑盒說(shuō)明書操作，配制檢測(cè)液，共孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)340 nm處的光密度值。

2.4PI和Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡PC12細(xì)胞經(jīng)處理后，用4%多聚甲醛固定10 min，使用50 mg·L-1PI和5 mg·L-1Hoechst 33342暗處染色15 min，在熒光顯微鏡下，以340 nm和560 nm的激發(fā)光波長(zhǎng)觀察染色情況，并計(jì)算細(xì)胞核形態(tài)改變所占比例。

2.5逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)基因表達(dá)利用合成的特異引物，對(duì)不同藥物刺激的PC12細(xì)胞的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增方法按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增體系如下：2×EasyTaq PCR SupperMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板20 ng cDNA，用0.1% DEPC水補(bǔ)足50 μL。引物序列見Tab 1。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 2 min；55℃ 30 s；72℃ 1 min；循環(huán)35次，最后一輪延伸5 min，4℃保存。

Tab 1 Gene-specific primers of rats used for reverse transcription PCR

2.6Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)PC12細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000×g離心，取上清進(jìn)行蛋白定量，取40 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5% BSA封閉，分別加入p53、caspase-9、β-actin抗體孵育4 h或過(guò)夜，隨后用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1紫鉚因改善丙酮醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷為建立丙酮醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)不同濃度的丙酮醛對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。如Fig 1A所示，1 mmol·L-1丙酮醛即有一定的毒性，丙酮醛對(duì)PC12細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為1.6 mmol·L-1。由于紫鉚因具有一定的神經(jīng)毒性，因此我們對(duì)紫鉚因?qū)C12細(xì)胞的毒性也進(jìn)行了研究，如Fig 1B所示，50 μmol·L-1紫鉚因使細(xì)胞活性下降36%，而25 μmol·L-1以下的紫鉚因均沒(méi)有細(xì)胞毒性。因此，我們采用0.625～10 μmol·L-1的紫鉚因預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h，隨后用1.5 mmol·L-1丙酮醛處理24 h，測(cè)定紫鉚因?qū)贡p傷的保護(hù)作用。如Fig 1C所示，2.5、5、10 μmol·L-1的紫鉚因均能提高丙酮醛導(dǎo)致的PC12細(xì)胞活性的下降。LDH釋放實(shí)驗(yàn)被用以檢測(cè)細(xì)胞毒性，F(xiàn)ig 1D結(jié)果表明，1.5 mmol·L-1丙酮醛大量升高LDH的值，而紫鉚因則下調(diào)丙酮醛誘導(dǎo)的LDH釋放。

Fig 1 The protective effect of butein on decreased cell viability induced by methylglyoxal (MG) in PC12 cells n= 5)

A: Cell viability was detected by MTT method in PC12 cells treated by MG; B: Cell viability was detected by MTT method in PC12 cells treated by butein; C: Cell viability was detected by MTT method in PC12 cells induced by 1.5 mmol·L-1MG before being pretreated by butein; D: Cell death was quantified by the release of LDH from the cells into the medium.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMG group．

3.2紫鉚因降低丙酮醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及壞死PI用以檢測(cè)細(xì)胞壞死，而Hoechst 33342則用以檢測(cè)細(xì)胞凋亡。如Fig 2所示，1.5 mmol·L-1的丙酮醛明顯增加PI紅色熒光，同時(shí)也可見藍(lán)色熒光顯示的細(xì)胞核固縮，可見丙酮醛能引起PC12細(xì)胞壞死，也誘導(dǎo)其凋亡。加入2.5、5 μmol·L-1的紫鉚因預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h，則明顯改善細(xì)胞的壞死及凋亡情況。星形孢菌素(Staurosporine，STS)被作為細(xì)胞壞死和凋亡的陽(yáng)性對(duì)照。

3.3丙酮醛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)為了探索丙酮醛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞壞死及凋亡的機(jī)制， RT-PCR檢測(cè)了caspase-9、Hspa1b、Gpx1、p53、SOD2、TNF-α基因的表達(dá)。如Fig 3所示，丙酮醛明顯升高促凋亡基因caspase-9和p53的表達(dá)，而降低細(xì)胞自由基清除基因SOD2的表達(dá)，但對(duì)于TNF-α基因的表達(dá)卻沒(méi)有明顯影響，表明其可能不引起TNF-α炎癥因子的過(guò)度產(chǎn)生。

3.4紫鉚因降低促凋亡基因的過(guò)表達(dá)及增加抗氧化基因的表達(dá)如Fig 4所示，2.5、5 μmol·L-1的紫鉚因能明顯降低caspase-9和p53的過(guò)度表達(dá)，同時(shí)也能明顯提高抗氧化基因SOD2的表達(dá)。

3.5紫鉚因降低丙酮醛誘導(dǎo)的caspase-9和p53蛋白的過(guò)度表達(dá)如Fig 5所示，1.5 mmol·L-1丙酮醛明顯增加促凋亡蛋白caspase-9和p53的表達(dá)(P<0.01)。2.5、5 μmol·L-1的紫鉚因能明顯抑制caspase-9和p53蛋白的過(guò)表達(dá)(P<0.05)。

4 討論

紫鉚因是一種多酚類化合物，多來(lái)自于紫鉚屬植物，而我們前期在兩色金雞菊中也分離得到了紫鉚因。由于其具有一定的神經(jīng)毒性，對(duì)蛞蝓和蝸牛具有較強(qiáng)的毒性作用，另外，紫鉚因還具有一定的胃毒性，其神經(jīng)毒性比胃毒性作用更強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的紫鉚因的確具有一定的細(xì)胞毒性，因此本實(shí)驗(yàn)采用較低劑量的紫鉚因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，2.5、5、10 μmol·L-1紫鉚因能明顯改善丙酮醛導(dǎo)致的細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡及壞死，同時(shí)降低促凋亡基因的過(guò)度表達(dá)，升高自由基清除蛋白SOD2的表達(dá)，且紫鉚因明顯改善丙酮醛誘導(dǎo)的促凋亡蛋白p53的過(guò)度表達(dá)。

Fig 2 Butein inhibited PC12 cells apoptosis induced by MG(scale bar: 50 μm)

The cells were treated with 1.5 mmol·L-1MG for 24 h before pretreatment with butein (2.5, 5 μmol·L-1) for 1 h.PI and Hoechst 33342 was used to determine cell apoptosis.

丙酮醛在糖尿病患者的血液中大量累積，對(duì)于各類器官都有損傷，如損傷腦部引起糖尿病腦部病變，損傷腎臟引起糖尿病腎損傷。丙酮醛是機(jī)體糖酵解產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)，在正常情況下主要由乙二醛酶系統(tǒng)代謝形成縮醛，并被乙二醛酶I代謝成D-乳酸，從而排出體外。而在糖尿病患者中，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽及乙二醛酶I活性下調(diào)，影響丙酮醛的正常代謝，導(dǎo)致其累積，損傷機(jī)體器官。有研究表明，在阿爾茨海默病患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)大量的丙酮醛，顯示其聚積對(duì)于形成阿爾茨海默癥有一定的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，丙酮醛明顯抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加其細(xì)胞毒性、LDH的釋放，且丙酮醛明顯激活促凋亡基因p53的表達(dá)。p53基因是一種最常見的促凋亡基因，可使細(xì)胞的增殖停滯于G期，是細(xì)胞凋亡及細(xì)胞阻滯的關(guān)鍵分子。在p53調(diào)節(jié)的凋亡細(xì)胞中，SOD2酶活性被抑制，而增加SOD2基因表達(dá)及酶活性，能明顯下調(diào)p53導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[11]。caspase-9是caspase凋亡家族的一員，由線粒體釋放的細(xì)胞色素C激活caspase-9的酶原剪切成caspase-9，發(fā)揮促凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，丙酮醛及高糖處理激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p53信號(hào)通路，促進(jìn)caspase-9活性的升高，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.5 mmol·L-1丙酮醛明顯導(dǎo)致細(xì)胞核固縮、聚積和碎裂成核小體，而紫鉚因處理組則明顯減少細(xì)胞核固縮，核小體的數(shù)量。丙酮醛劑量依賴性地抑制抗氧化基因SOD2的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡基因p53和caspase-9的表達(dá)。有研究表明，用丹參酮IIA處理明顯下調(diào)p53蛋白的過(guò)量表達(dá)，從而降低丙酮醛誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低劑量紫鉚因同樣具有降低p53基因及蛋白過(guò)表達(dá)的作用，增加SOD2基因表達(dá)，從而調(diào)控caspase-9的高表達(dá)，起到降低丙酮醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用。

糖尿病發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，丙酮醛的毒性機(jī)制也并不十分清楚。紫鉚因作用于p53基因的具體機(jī)制還不清楚，因此，紫鉚因下調(diào)促凋亡蛋白p53、caspase-9，上調(diào)抗氧化基因SOD2的表達(dá)，起到對(duì)抗丙酮醛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

Fig 3 MG induced cell apoptotic gene expressions and inhibited antioxidant gene n=5)

A: RT-PCR analysis for mRNA obtained from cells treated by different concentrations of MG; B: Optical density of the bands was analyzed with ImageJ software.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 4 Butein improved key gene expressions involved

A: RT-PCR analysis for mRNA obtained from cells treated by butein in presence or absence of MG; B:Optical density of the bands analyzed with ImageJ software.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMG group.

Fig 5 Butein inhibited p53 and caspase-9 protein

A: Western blot analysis for protein expression obtained from cells treated by butein in presence or absence of MG; B Optical density of the bands analyzed with ImageJ software.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMG group.

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