王靳琎，楊曉梅，蘇麗萬(wàn)，錢(qián) 航，謝 露

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，湖北 十堰 442000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的一種慢性疾病，而內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是AS啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)損傷后，引發(fā)的一系列血管壁組織病理變化，而慢性炎癥反應(yīng)是AS形成的中心環(huán)節(jié)。因此，慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)可作為尋求抗AS藥物研究的靶點(diǎn)。本課題組從廣西北部灣海帶中分離、提純后得到一種含量較高的多糖組分L01，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗凝和抗血栓形成作用，可對(duì)抗腎上腺素對(duì)VECs的損傷，保護(hù)VECs結(jié)構(gòu)完整性，并能維持心理應(yīng)激大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能[1-2]，這些均提示L01在防止心血管疾病方面具有潛在價(jià)值。因此，我們假設(shè)L01對(duì)VECs的保護(hù)作用也與影響炎癥反應(yīng)有關(guān)，本研究以大鼠尾靜脈間斷注射小劑量脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制備慢性炎癥模型，觀察海帶多糖L01對(duì)慢性炎癥模型大鼠的內(nèi)皮炎癥因子及內(nèi)皮源性舒張因子的影響，探討其對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。

1 材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(190±10)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK桂014-0003。

1.2藥品與試劑海帶多糖由本課題組自行提取，其糖含量占71.0%，硫酸根含量為83.28 mg·g-1，無(wú)菌生理鹽水稀釋過(guò)濾后備用。大腸桿菌脂多糖(血清型O55:B5)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)CLOUD-CLONE CORP公司；TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；PCR引物，由上海生工生物工程公司合成；2×Taq PCR Master Mix，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3儀器全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信科技公司)；臺(tái)式低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀(美國(guó)Life Technologies公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)。

2 方法

2.1海帶多糖L01的提取按本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道方法[3]，使用酶解堿浸法消化海帶細(xì)胞壁纖維素，提取胞壁多糖，并進(jìn)一步采用DEAE-纖維素柱層析法，從海帶胞壁多糖中分離純化得到新的單一組分海帶多糖L01。

2.2慢性炎癥大鼠模型制備及方法可行性驗(yàn)證SD大鼠40只隨機(jī)均分為對(duì)照組、LPS 1周組、LPS 2周組、LPS 3周組、LPS 4周組(分別用LPS處理1、2、3、4周)，除對(duì)照組外，各LPS組大鼠按照分組設(shè)定的處理時(shí)限，尾靜脈注射LPS(0.4 mg·kg-1)，每周1次，對(duì)照組大鼠同法尾靜脈注射等體積無(wú)菌生理鹽水，觀察各組大鼠的存活情況。分別于第1、2、3、4周末，將對(duì)應(yīng)組大鼠進(jìn)行全血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)和血清hs-CRP測(cè)定，驗(yàn)證其炎癥狀態(tài)。

2.3分組與給藥48只大鼠隨機(jī)均分為6組，分別為對(duì)照組，LPS組，LPS+DXM(10 mg·kg-1)組， LPS+L01高、中、低劑量(50、30、10 mg·kg-1)組。除對(duì)照組外，其他各組大鼠尾靜脈注射LPS(0.4 mg·kg-1)無(wú)菌生理鹽水溶液，每周1次，共計(jì)4周。首次注射LPS后次日，各給藥組開(kāi)始腹腔注射相應(yīng)劑量DXM或L01，對(duì)照組、LPS組腹腔注射生理鹽水，每天1次，共4周。

2.4標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1樣本采集 末次給藥后，各組大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.1的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，正中切口打開(kāi)腹腔，撥開(kāi)覆蓋下腔靜脈的臟器，清晰暴露出血管，于下腔靜脈穿刺取血，用于全血WBC計(jì)數(shù)和血清hs-CRP測(cè)定。鈍性分離主動(dòng)脈，置于冰生理鹽水中，清洗血液，同時(shí)迅速去除血管周?chē)M織，放入潔凈EP管中，放置于-80℃超低溫冰箱保存，用于抽提血管總RNA。

2.4.2全血WBC計(jì)數(shù)及血清hs-CRP、eNOS、iNOS測(cè)定 取全血20 μL，加入白細(xì)胞稀釋液380 μL，充分混勻后充入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行WBC計(jì)數(shù)。全血標(biāo)本離心后，取上層血清，采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)hs-CRP、eNOS、iNOS含量，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.4.3RT-PCR檢測(cè)血管中 eNOS、iNOS、COX-2 mRNA表達(dá) 取約50 mg血管加入1 mL TRIzol，放置在冰上，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理。TRIzol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。以目的基因與內(nèi)參基因β-actin的比值作為基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequence, amplification product length of RT-PCR reaction

3 結(jié)果

3.1大鼠慢性炎癥模型驗(yàn)證尾靜脈注射LPS 4周內(nèi)，全部大鼠均存活，LPS給藥結(jié)束后，大鼠全血WBC總數(shù)與血清hs-CRP質(zhì)量濃度均明顯增加并維持在較高水平，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)，且LPS 4個(gè)時(shí)間段組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示每周尾靜脈給與LPS制備大鼠慢性炎癥模型是可行的(Fig 1)。

Fig 1 Peripheral blood leukocyte number(A) and level of serum hs-CRP(B) in rats with chronic n=8)

**P<0.01vscontrol group

3.2海帶多糖L01對(duì)全血WBC數(shù)與血清hs-CRP水平的影響如Fig 2所示，與對(duì)照組比較，LPS組大鼠全血WBC計(jì)數(shù)與血清hs-CRP水平明顯升高(P<0.01)。與LPS組比較，DXM和L01高劑量都能明顯抑制LPS引起的全血WBC增多(P<0.05)，L01中、低劑量雖然也有降低全血WBC作用，但與LPS組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DXM和L01高、中、低劑量都能明顯抑制LPS引起的血清hs-CRP水平升高(P<0.01)。

Fig 2 Effects of L01 on total number of peripheral blood leukocyte number(A) and level of serum hs-CRP(B) in rats

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group

3.3海帶多糖L01對(duì)血清e(cuò)NOS、iNOS水平的影響如Fig 3所示，與對(duì)照組比較，LPS組大鼠血清e(cuò)NOS水平明顯降低(P<0.01)，iNOS水平明顯升高(P<0.01)。與LPS組比較，DXM和L01高、中劑量明顯抑制LPS引起的血清e(cuò)NOS水平降低(P<0.01)。DXM和高劑量L01明顯抑制了LPS引起的血清iNOS水平升高(P<0.01)。L01中、低劑量雖然也可降低血清iNOS水平，但與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 3 Effects of L01 on level of serum eNOS(A) and level of serum iNOS(B) in rats with chronic

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group

3.4海帶多糖L01對(duì)主動(dòng)脈eNOS、iNOS、COX-2基因表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對(duì)照組比較，LPS組大鼠主動(dòng)脈eNOS基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01), iNOS、COX-2基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。與LPS組比較，DXM和L01高、中、低劑量明顯抑制LPS引起的eNOS基因表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，以及iNOS、COX-2基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

4 討論

慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂的主要因素。革蘭陰性桿菌感染及其誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥是引發(fā)和加重多種慢性炎癥疾病的主要原因，其菌體細(xì)胞壁的LPS是內(nèi)毒素的主要成分[4]，由 LPS介導(dǎo)的病理與生理變化在慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的建立慢性炎癥模型的方法是間斷尾靜脈注射小劑量LPS[5]。許多實(shí)驗(yàn)表明，全血WBC計(jì)數(shù)與血清hs-CRP水平可作為評(píng)估LPS誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的指標(biāo)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中，注射LPS后第1周末即出現(xiàn)WBC總數(shù)明顯增加，以及循環(huán)中重要的炎性細(xì)胞因子hs-CRP水平的明顯上升。

Fig 4 Effects of L01 on expression of eNOS(A), iNOS(B) and COX-2(C) mRNA in aorta in rats with

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group

隨后3周WBC總數(shù)和血清hs-CRP水平雖有所下降，但仍維持較高的水平，且LPS給藥組的4組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上表明炎癥持續(xù)存在并有慢性化的征象。慢性炎癥的病程一般持續(xù)幾周甚至數(shù)月，這些均提示以0.4 mg·kg-1LPS間斷尾靜脈注射4周制備SD大鼠慢性炎癥模型是可行的。

AS的病理基礎(chǔ)是內(nèi)皮功能失調(diào)，而炎癥反應(yīng)是AS形成的中心環(huán)節(jié)。在慢性炎癥過(guò)程中，調(diào)節(jié)NO等舒張因子是治療心血管疾病的關(guān)鍵[8]。一氧化氮合酶是體內(nèi)的NO合成關(guān)鍵酶,可以調(diào)節(jié)NO的生成、維持正常水平的NO濃度和內(nèi)皮功能，其主要分為eNOS和iNOS。目前，抗炎藥物對(duì)血管內(nèi)皮功能有一定的調(diào)節(jié)作用，且表現(xiàn)出一定的抗AS作用，如甾體抗炎藥DXM。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇DXM作為藥物對(duì)照組[9]。

eNOS表達(dá)水平的變化是影響內(nèi)皮NO產(chǎn)生的重要因素。血管內(nèi)皮釋放的NO可以使平滑肌松弛、動(dòng)脈血管擴(kuò)張，從而調(diào)節(jié)血流的分布[10]，這些均有利于阻止AS的發(fā)生發(fā)展。eNOS活性降低時(shí)，NO產(chǎn)生減少，血小板易于黏附聚集，血管收縮，動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，促使AS的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中，LPS組大鼠血清和主動(dòng)脈eNOS水平明顯低于正常組，L01給藥治療后明顯提高了eNOS水平。正常情況下iNOS并不表達(dá)，一些外源刺激如干擾素類(lèi)、炎癥因子等都可激活iNOS[11]。LPS是最主要的iNOS誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠在LPS刺激下，血清和主動(dòng)脈iNOS水平均明顯升高。LPS是在DNA轉(zhuǎn)錄水平對(duì)iNOS的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，該過(guò)程中iNOS表達(dá)及活性增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量超出生理濃度的NO，使得過(guò)氧化硝酸鹽的形成增加，導(dǎo)致血管一定程度的損傷，進(jìn)而促進(jìn)了AS的發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)中，L01給藥治療后明顯降低了iNOS mRNA的表達(dá)水平。

COX-2是一種啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵誘導(dǎo)型合酶。當(dāng)COX-2被誘導(dǎo)大量生成與表達(dá)時(shí)，慢性炎性反應(yīng)將被放大和增強(qiáng)[13-14]。COX-2可誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子的合成，使得新生血管增多，從而促進(jìn)了粥樣斑塊病變的發(fā)生與發(fā)展。在整個(gè)炎癥的發(fā)生與消退修復(fù)過(guò)程中，可見(jiàn)COX-2大量、持續(xù)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，LPS組主動(dòng)脈COX-2 mRNA水平明顯升高，L01治療性給藥后能明顯抑制這種現(xiàn)象。

綜上所述, 海帶多糖L01可明顯改善血管內(nèi)皮的依賴(lài)性舒張功能，其作用機(jī)制可能在于L01能明顯提高eNOS mRNA的表達(dá)，降低炎癥時(shí)活躍的iNOS mRNA表達(dá)。

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