袁鳳霞,田 莎,曹曉虹,劉建利,王軍節(jié),張 琇,李靖宇,宋 峰,李學(xué)斌,覃璐琪,鄧鵬程,王曉丹

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院；發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；寧夏特殊生境微生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川 750021)

乳制品由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用,是人們生活必備食品。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳制品制作過(guò)程中的微生物與乳制品風(fēng)味、口感、質(zhì)地等品質(zhì)密切相關(guān)[1]。乳酸菌最早被發(fā)現(xiàn)是乳制品加工過(guò)程中發(fā)揮作用的主要微生物[2-3]。但自從在開(kāi)菲爾(Kefir)[4-7]、酸馬奶(Koumiss)[8-13]中酵母菌的重要作用被發(fā)現(xiàn)后,在越來(lái)越多的乳制品如:發(fā)酵駝乳酪乳清[14]、原料乳和奶酪[15-16]、奶渣[17]、曲拉和乳餅[18-19]、發(fā)酵乳[20]等中也有大量酵母菌被分離出。隨著酵母菌抑菌、降膽固醇、抗氧化、活化集體免疫系統(tǒng)等生理功效的發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)乳制品中酵母菌越來(lái)越被關(guān)注。酸乳作為乳制品中銷(xiāo)售增長(zhǎng)最快的產(chǎn)品,新型酸乳研發(fā)是各大乳企研發(fā)熱點(diǎn),然而利用特殊酵母菌開(kāi)發(fā)新型酸乳發(fā)酵菌劑卻鮮有開(kāi)展。

西北、西南、東北民族地區(qū)的少數(shù)民族食用各種發(fā)酵食品有著悠久的歷史,千百年來(lái)沿襲古老而傳統(tǒng)的方法制作酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳餅等乳酸菌發(fā)酵食品,方法簡(jiǎn)單、風(fēng)味獨(dú)特、組織細(xì)膩、口感純正,在當(dāng)?shù)刈匀粶囟认麓娣泡^長(zhǎng)時(shí)間還能保證其口感和狀態(tài)。在這些傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中應(yīng)該含有豐富、獨(dú)特的優(yōu)良微生物資源包括酵母菌資源，這些共生酵母資源有待挖掘。

本實(shí)驗(yàn)以前期從新疆、西藏和青海等地收集的傳統(tǒng)自制乳制品中分離的27株酵母菌為基礎(chǔ),將酵母菌株分別和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)共同發(fā)酵制備酸乳,以保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵作為對(duì)照,通過(guò)比較凝乳時(shí)間、感官特性、質(zhì)地特性、后酸度、粘度、持水力、產(chǎn)香能力等特征,篩選酸乳發(fā)酵中與保加利亞乳桿菌優(yōu)良共生的酵母菌株,為開(kāi)發(fā)新型酸乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母菌 青海西寧牦牛酸乳分離的“QX1”-“QX15”,青海大通縣酸乳中分離的“QD1”～“QD3”,山東酸乳中分離的“SD1”、“SD2”,從西藏拉薩、那曲、山南酸牦牛乳中分離的“XS1”、“XN1”～“XN6”;保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus) 菌株MUNLd1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白胨、酵母提取物 英國(guó)Oxoid公司;牛肉浸粉 青島海博生物公司;乙醛標(biāo)準(zhǔn)品 北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;酵母基因組提取試劑盒 康為世紀(jì)生物科技有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye) 北京全式金生物技術(shù)有限公司;檸檬酸二銨、檸檬酸銨、蔗糖、碘、三氯乙酸、鄰苯二胺、鹽酸、亞硫酸氫鈉、酚酞、氫氧化鈉、酒精、氯化鈣、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀 化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;純牛奶 伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司。

1%鄰苯二胺 準(zhǔn)確稱(chēng)取鄰苯二胺0.25 g,溶于4 mol/L鹽酸中,置于25 mL容量瓶?jī)?nèi),用4 mol/L鹽酸補(bǔ)足至刻度,貯于棕色瓶中,臨用時(shí)配制。

MRS培養(yǎng)基(1L) 胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、牛肉浸粉10 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、磷酸氫二鉀2.6 g、硫酸錳0.19 g,調(diào)節(jié)pH為6.2～6.4之間。

YPD培養(yǎng)基 1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。

26S rDNA D1/D2區(qū)引物 NL1:5′-GCATATCG GTAAGCGGAGGAAAA-3′;NL4:GGTCCGTGTTTCAA GACGG-3′;ITS1區(qū)引物 ITS1:5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGC-3′;ITS2 5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。

TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)FTC公司;NDJ-8S型粘度計(jì) 上海庚庚儀器設(shè)備公司;S1000型快速梯度PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;1-14型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌株和保加利亞乳桿菌株的活化 取保藏的27株酵母菌和保加利亞乳桿菌株分別接入YPD、MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)24 h,6000 r/min,4 ℃離心10 min,棄去上層培養(yǎng)液,加入無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濃度大于1×1010cfu/mL,制成菌懸液備用。

1.2.2 酸乳的制備 參考劉敏敏[8]、余蘭[14]、李先勝[19]等方法,30 mL含蔗糖的牛奶(15%),高壓滅菌鍋95 ℃滅菌5 min,待冷卻后,接入3 mL保加利亞乳桿菌懸液和1 mL酵母菌菌懸液,40 ℃培養(yǎng),記錄凝乳時(shí)間,凝乳后4 ℃冷藏24 h后熟,進(jìn)行后續(xù)混菌酸乳特性評(píng)價(jià);以接入3 mL保加利亞乳桿菌懸液和1 mL生理鹽水的樣品作為單菌發(fā)酵對(duì)照。

1.2.3 酸乳特性評(píng)價(jià)

1.2.3.1 酸乳感官評(píng)價(jià) 參考生慶海等[21]方法,制定感官評(píng)價(jià)表,將后熟24 h的酸乳取出后,隨機(jī)選15名北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院2014級(jí)食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)學(xué)生依據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其氣味、質(zhì)地、口感三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)定,計(jì)算平均值。

表1 酸乳感官評(píng)價(jià)打分表Table 1 Sensory evaluation scale of yoghourt

1.2.3.2 酸乳持水力測(cè)定 參考張?zhí)m威[22]的方法,準(zhǔn)確稱(chēng)取后熟24 h的酸乳15 g,4500 r/min離心10 min,取上清液,稱(chēng)取質(zhì)量。持水力(%)=(樣品質(zhì)量-上清液質(zhì)量)/樣品質(zhì)量×100。

1.2.3.3 酸乳質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 參考徐鑫[23]、赫君菲[24]和楊瑩瑩[25]等方法,測(cè)試探頭型號(hào)為T(mén)MS-75 mm圓盤(pán)擠壓探頭P/75。測(cè)試條件如下:測(cè)前速率為30 mm/min;測(cè)后速率與測(cè)前速率一致;兩次壓縮之間的停留間隔:0 s;采樣速度:10 Hz;最小觸發(fā)力:0.3 N。

1.2.3.4 酸乳滴定酸度測(cè)定 按照GB 5009.239-2016[26],加5 g 4 ℃貯存1、3、7 d酸乳、40 mL冷卻煮沸水和5滴已經(jīng)配好的酚酞酒精溶液(濃度為5 g/L),于250 mL三角瓶充分搖勻,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為0.1000 mol/L)滴定至微紅色,在30 s內(nèi)顏色不消失即為滴定終點(diǎn),記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)。將所得結(jié)果代入公式中計(jì)算滴定酸度。

X(°T)=c×V×100/m×0.1，X-發(fā)酵乳樣品的酸度,單位為度(°T)，吉爾涅爾度°T,100 g發(fā)酵乳消耗0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積;c-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度,單位為摩爾每升(mol/L);V-滴定時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,單位為毫升(mL);m-發(fā)酵乳樣品的質(zhì)量,單位為克(g);0.1-酸度理論定義NaOH的摩爾濃度,單位為摩爾每升(mol/L)。

1.2.3.5 酸乳中雙乙酰含量測(cè)定 鄰苯二胺法[27]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取12支編號(hào)試管分成2排放置,并分別加0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各2支,分別用蒸餾水補(bǔ)足10 mL,取5.0 mL上述雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液加入5 mL 16%三氯乙酸溶液,得到雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 μg/mL,在335 nm波長(zhǎng)下用石英比色皿測(cè)定吸光度值。以雙乙酰質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中雙乙酰含量的測(cè)定:取后熟24 h的酸乳10 mL加三氯乙酸(濃度為16%)溶液10 mL,靜置10 min后4500 r/min,4 ℃離心10 min,過(guò)濾后取上清液10 mL,加0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鄰苯二胺搖勻,放置黑暗處?kù)o置30 min。待反應(yīng)完全后加入濃度為4.0 mol/L的鹽酸,波長(zhǎng)335 nm石英比色皿測(cè)定吸光度值,代入標(biāo)曲計(jì)算樣品中含量。

1.2.3.6 酸乳中乙醛含量測(cè)定 滴定法[28]。取5 mL樣品加入5.00 mL三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%),充分搖勻,12000 r/min,4 ℃離心10 min,在250 mL錐形瓶中加入5 mL上清液2.00 mL 1% NaHSO3的搖勻,室溫放置1 h后,加入1 mL 1%淀粉溶液,用0.01 mol/L碘液滴至淡藍(lán)色,且在30 s不褪色即為滴定終點(diǎn)。再加入20 mL 1 mol/L NaHCO3,振蕩到藍(lán)色退去,再用0.01 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色,30 s不褪去,記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)碘液的體積,按如下公式計(jì)算乙醛的含量。

乙醛(mg/L)=(V1-V2)×c×0.022/10

式中:V2為空白滴定消耗碘液標(biāo)準(zhǔn)的體積,mL;V1為樣品滴定消耗碘液標(biāo)準(zhǔn)的體積,mL;c為1/2碘液標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;10為乙醛樣品稱(chēng)樣量,mL;0.022為乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單位,g。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS11.0軟件ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,用LSD進(jìn)行多重比較,圖表在Excel中生成。

1.2.5 優(yōu)良共生酵母菌株分子鑒定 參照酵母菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū);PCR擴(kuò)增26S rDNAD1/D2區(qū)、ITS1區(qū)反應(yīng)體系為(50 μL):10×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)閰⒖糑urtzman等[29]：取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè),剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由南京金斯瑞生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)鑒定。參考序列選自Kurtzman等[29],以SchizosaccharomycespombeD1D2區(qū)序列(U40085.1)和Hanseniasporaoccidentalis的ITS序列(AY046203.1)為outgroup,將所有序列輸入在Mega Ver6.0軟件[30]中打開(kāi),alignment文件,手動(dòng)修正掐頭去尾,輸出fasta格式;將修正后的fasta文件用DAMBE Ver 5.3.4軟件[31]轉(zhuǎn)化成phylip 4格式(間斷)(但名稱(chēng)全);再在記事本中打開(kāi),將“？”用“-”替換;用CIPRES Science Gateway[32]中在線RAxML-HPC2 Blackbaox[33]建ML進(jìn)化樹(shù);在Figtree中編輯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵酸乳凝乳時(shí)間比較

凝乳時(shí)間與乳酸菌在酸乳發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖、活力、產(chǎn)酸能力密切相關(guān)[1],本實(shí)驗(yàn)中27株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵樣品與對(duì)照組發(fā)酵樣品在6 h都出現(xiàn)部分凝乳,8 h都完全凝乳,二者并未出現(xiàn)明顯差別,酵母菌的加入對(duì)酸乳發(fā)酵中凝乳時(shí)間無(wú)明顯影響。

2.2 不同菌株混菌發(fā)酵酸乳感官評(píng)價(jià)比較

感官評(píng)價(jià)是酸乳品質(zhì)測(cè)評(píng)的重要手段,本實(shí)驗(yàn)以保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵酸乳為對(duì)照,對(duì)27株酵母菌與乳酸菌混合發(fā)酵后熟24 h酸乳從質(zhì)地、氣味和口感方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià),由表2可得,從青海西寧牦牛酸乳分離的“QX1”～“QX15”和青海大通縣酸乳中分離的“QD1”～“QD3”共18株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵酸乳樣品有明顯的酒精味,掩蓋了奶香味,但無(wú)其他異味,大多乳清析出也較多(質(zhì)地得分約6分),部分有明顯的“豆腐渣”狀(質(zhì)地得分約10分),口感偏甜(得分約10～15分)或酸甜分明(得分約20～25分),總體得分在80分以下;而從山東酸乳中分離的“SD1”、“SD2”和從西藏拉薩、那曲、山南酸牦牛乳中分離的“XS1”、“XN1”～“XN6”這9株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵酸乳樣品奶香味比較明顯,也無(wú)明顯的乳清析出,質(zhì)地均勻細(xì)膩,酸乳適中,融合感較好,總體得分在80分以上。因此,選擇“SD1”、“SD2”、“XS1”、“XN1”、“XN2”、“XN3”、“XN4”、“XN5”、“XN6”這9株酵母菌作為下一步實(shí)驗(yàn)菌株。

表2 不同菌株發(fā)酵酸乳感官評(píng)定得分Table 2 Sensory evaluation scores of yoghourt fermented with different strains

2.3 不同菌株發(fā)酵酸乳持水力比較

酸乳持水力指酸乳保質(zhì)期內(nèi)乳清析出的多少,反映不同質(zhì)地酸乳對(duì)乳清的截留能力,越大表示酸乳質(zhì)地越優(yōu)。9株酵母菌“SD1”、“SD2”、“XS1”、“XN1”、“XN2”、“XN3”、“XN4”、“XN5”、“XN6”和保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵后熟24 h酸乳和對(duì)照酸乳樣品的持水力均為100%,與感官評(píng)價(jià)中觀察到的乳清析出情況一致。

2.4 不同菌株發(fā)酵酸乳質(zhì)構(gòu)分析比較

感官評(píng)價(jià)法一般采用暫時(shí)的評(píng)分系統(tǒng),局限性很大,而且這種評(píng)定費(fèi)時(shí)費(fèi)力,受評(píng)價(jià)員的情緒、健康狀況等多種因素影響,穩(wěn)定性不足。質(zhì)構(gòu)儀通過(guò)模擬人的口腔咀嚼功能,用具體的數(shù)據(jù),客觀地將人的觸覺(jué)感受分解成硬度、咀嚼性、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性等幾個(gè)部分,9株酵母菌和保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵酸乳樣品和對(duì)照酸乳樣品質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)如圖1～圖4所示,“XS1”菌株混菌發(fā)酵酸乳的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)最好。

圖1 不同菌株發(fā)酵酸乳破裂力、硬度、粘附性Fig.1 The rupture force,adhesiveness and hardness of yoghourt fermented with different strains注:不同字母的均值間存在顯著差異(p<0.01),圖2～圖4,圖6～圖7、表3同。

圖2 不同菌株發(fā)酵酸乳最大粘附力、內(nèi)聚力、膠黏性Fig.2 The tackiness,maximum adhesion force and hardness of yoghourt fermented with different strains

圖3 不同菌株發(fā)酵酸乳彈性Fig.3 Elasticity of yoghourt fermented with different strains

圖4 不同菌株發(fā)酵酸乳咀嚼性Fig.4 Chewiness of yoghourt fermented with different strains

表3 不同菌株發(fā)酵酸乳滴定酸度變化Table 3 Titratable acidity of yoghourt with different strains

2.5 不同菌株發(fā)酵酸乳滴定酸度比較

發(fā)酵結(jié)束后,后熟好的酸乳,酸度要適中,同樣發(fā)酵8 h后的樣品,所有混菌發(fā)酵酸乳的酸度都比對(duì)照高,其中菌株“XS1”混菌發(fā)酵樣品酸度最高;但冷藏保存7 d后,“XS1”混菌酸乳的后酸變化卻最小,只有4 °T,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照。

2.6 不同菌株發(fā)酵酸乳產(chǎn)香能力比較

酸乳中雙乙酰和乙醛含量與其香味有關(guān),利用雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),檢測(cè)9株菌混合發(fā)酵酸乳樣品以及單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中的雙乙酰含量,除“XN3”、“XN2”、“XN5”混菌發(fā)酵酸乳雙乙酰含量明顯低于對(duì)照外(“XN3”、“XN2”、“XN5”的p值分別為0.009、0.003、0.004),其余所有的混菌發(fā)酵樣品中雙乙酰含量明顯大于對(duì)照(“XN1”、“XN4”、“XN6”、“XS1”、“SD1”、“SD2”p值分別為0.008、0.008、0.008、0.0009、0.009、0.0008),其中“SD2”最高(14.83 μg/mL),“XS1”次之(12.65 μg/mL)(圖6)。而在乙醛含量方面,只有“SD2”和“XN3”混菌發(fā)酵酸乳的乙醛含量均高于對(duì)照,“XS1”混菌發(fā)酵酸乳的乙醛含量低于對(duì)照,其余樣品于對(duì)照無(wú)顯著差異(圖7)。

圖5 雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of diacetyl

圖6 不同菌株發(fā)酵酸乳中雙乙酰含量Fig.6 The content of diacetyl in yoghourtfermented with different strains

圖7 不同菌株發(fā)酵酸乳中乙醛含量測(cè)定結(jié)果Fig.7 The content of acetaldehyde in yoghourt fermented with different strains

2.7 優(yōu)良共生酵母菌株“XS1”的鑒定結(jié)果

菌株“XS1”在YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)均為白色、圓形或橢圓形、不透明、有粘性、光滑濕潤(rùn),美蘭染色后顯微孢子形態(tài)為橢圓形、圓形或卵圓形,可見(jiàn)出芽生殖(圖8),提取該菌株基因組DNA,采用PCR擴(kuò)增26S rDNA D1D2和ITS1序列。測(cè)序后分別獲得約650 bp和300 bp序列,將該序列在NCBI中比對(duì),結(jié)果顯示“XS1”的26S rDNA D1D2和ITS1序列與Kluyveromycesmarxianus的序列相似度高達(dá)99%;基于Holzapfel等分類(lèi)系統(tǒng)參考序列,利用“XS1”菌株的26S rDNA D1D2和ITS1區(qū)序列,分別構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示“XS1”與Kluyveromycesmarxianus聚在一起(圖9、圖10)。得出“XS1”為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)菌株。

圖8 “XS1”菌落圖片和細(xì)胞顯微圖片F(xiàn)ig.8 The colony and cell of “XS1” strain

圖9 基于26S rDNA D1D2區(qū)構(gòu)建的Kluyveromyces屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 The phylogenetic tree of Genus Kluyveromyces based on 26S rDNA D1D2 sequences

圖10 基于ITS1區(qū)構(gòu)建的Kluyveromyces屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.10 The phylogenetic tree of Genus Kluyveromyces based on ITS1 sequences

3 討論

乳酸菌和酵母菌是食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的兩種微生物。長(zhǎng)期以來(lái),乳制品中的酵母僅作為一種污染菌和腐敗菌而備受人們關(guān)注,隨著各種乳制品中酵母被大量分離,酵母菌在乳制品中的有益作用開(kāi)始被關(guān)注,尤其是馬克斯克魯維酵母被發(fā)現(xiàn)是開(kāi)菲爾[4-5]和酸馬奶[11-13]中的優(yōu)勢(shì)酵母菌。隨著對(duì)發(fā)酵乳制品中酵母菌研究的深入,越來(lái)越多的馬克斯克魯維酵母菌在其他各種乳制品中不斷被分離出來(lái)[34],Bai等[20]分別從青海地區(qū)和西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中分離出馬克斯克魯維酵母;王遠(yuǎn)微等[35]報(bào)道對(duì)川西北部分牧區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳樣品中酵母菌優(yōu)勢(shì)菌是馬克斯克魯維酵母;謝婕等[36]發(fā)現(xiàn)羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中分離到的酵母菌中有17株是馬克斯克魯維酵母;李宇輝等[37]報(bào)道馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是新疆伊犁牧區(qū)少數(shù)民族家中采集奶疙瘩樣品中的共同菌株;李銀聰[38]發(fā)現(xiàn)西藏和川西青藏高原牧民自制的自然發(fā)酵酸耗牛奶也存在馬克斯克魯維酵母。本實(shí)驗(yàn)中篩選的馬克斯克魯維酵母菌株“XS1”從西藏山南地區(qū)收集的牦牛酸乳樣品分離獲得。

本實(shí)驗(yàn)將保加利亞乳桿菌和酵母菌混菌發(fā)酵制備酸乳,混菌發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)不同代謝能力菌種的組合,完成單個(gè)菌種難以完成的多種復(fù)雜代謝反應(yīng),提高生產(chǎn)效率。目前關(guān)于混菌發(fā)酵過(guò)程中酵母菌和乳酸菌之間的共生作用研究甚少。有報(bào)道在乳制品發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌首先利用環(huán)境中的乳糖生長(zhǎng),通過(guò)自身的代謝途徑反應(yīng)生成乳酸降低了環(huán)境的pH,為酵母菌的代謝提供了條件,因?yàn)榻湍妇钸m宜在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng),同時(shí)一些乳酸菌發(fā)酵乳糖的副產(chǎn)物為半乳糖,能夠?yàn)椴话l(fā)酵乳糖而利用半乳糖的酵母提供碳源;另一方面,乳酸菌產(chǎn)生的乳酸引起pH降低會(huì)對(duì)自身的代謝產(chǎn)生抑制作用,此時(shí)酵母菌在生長(zhǎng)消耗乳酸鹽,環(huán)境pH就不斷升高,這樣就減緩了環(huán)境中的pH太低而導(dǎo)致乳酸菌的反饋抑制。另外,酵母菌代謝所產(chǎn)生的物質(zhì),如丙酮酸、維生素和氨基酸等其他復(fù)合物也會(huì)刺激乳酸菌進(jìn)一步代謝,這就為兩種菌之間的相互促進(jìn)提供了良好的基礎(chǔ)[39-40]。本實(shí)驗(yàn)部分菌株混菌發(fā)酵結(jié)果也證明了這種相互促進(jìn)作用，但僅使用一種保加利亞乳桿菌和酵母菌混合發(fā)酵酸乳進(jìn)行研究,實(shí)際生產(chǎn)中常使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合發(fā)酵,球菌、桿菌有各自不同的發(fā)酵特性,發(fā)酵產(chǎn)物也有差異,菌株越多相互關(guān)系就越復(fù)雜,以初步篩選的混菌發(fā)酵酸乳在感官評(píng)價(jià)得分較高9株酵母菌為基礎(chǔ),研究保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酵母菌混合發(fā)酵對(duì)酸乳的影響,是本實(shí)驗(yàn)下一步的工作。

不同類(lèi)型發(fā)酵酸乳中酵母菌和乳酸菌的相互作用可能存在差異,乳酸菌和酵母菌的種類(lèi)及其接種比例、發(fā)酵條件都有可能影響兩者之間的共生作用,本實(shí)驗(yàn)只選擇了乳酸菌和酵母菌比例是3∶1,培養(yǎng)條件也只選擇了保加利亞乳桿菌最佳生長(zhǎng)溫度40 ℃,對(duì)于其他條件參數(shù)還需后續(xù)研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵為對(duì)照,從27株酵母菌中篩選獲得1株馬克斯克魯維酵母菌株“XS1”,該菌株與保加利亞乳桿菌混菌發(fā)酵的酸乳在質(zhì)地特性、后酸度、粘度、持水力、產(chǎn)香能力等方面表現(xiàn)優(yōu)良,有望應(yīng)用于開(kāi)發(fā)獨(dú)特風(fēng)味和口感的酵母菌-乳酸菌復(fù)合發(fā)酵酸乳。

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