薛志靜，莊桂芬，黃振東，萬(wàn)晴，張瑞玲，張忠

1.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016； 2. 山東省新發(fā)傳染病溯源與防控協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 泰安 271016

蠐螬是金龜子的幼蟲，是我國(guó)農(nóng)作物、果樹(shù)、林木的重要地下害蟲，我國(guó)記錄的有1 800余種[1]，其中危害農(nóng)、林、牧草的有110余種[2]。在黃淮海地區(qū)主要以銅綠麗金龜(Anomalacorpulentamotschulsky)、華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblitafaldermann)和暗黑鰓金龜(H.parallelamotschulsky)3種為主[3]。多數(shù)蠐螬以植物根莖為食或營(yíng)腐生生活，需要降解植物和土壤中的纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)，以獲得生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)和能量[4]。已有研究表明，銅綠麗金龜幼蟲后腸膨大，形成富含細(xì)菌的特殊發(fā)酵腔結(jié)構(gòu)，生活著種類多樣的微生物，這些腸道微生物可以產(chǎn)生消化酶，消化酶活性的高低決定了蠐螬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力和生長(zhǎng)發(fā)育速度[5-7]。在已確定不同生態(tài)環(huán)境中銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌組成的基礎(chǔ)上[7]，本文采用兩種方法研究了腸道細(xì)菌的產(chǎn)消化酶活性，為篩選產(chǎn)消化酶高活性菌株用于微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株 所有菌株均為本實(shí)驗(yàn)室自兩個(gè)不同生境(野外廢棄的菜園和花生田)的銅綠麗金龜幼蟲分離并鑒定得到。

1.2儀器和試劑 主要儀器設(shè)備：752sp紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、電冰箱、光照培養(yǎng)箱、SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)、HNY-2102C搖床、高精度數(shù)顯恒溫水浴鍋、FA/JA電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)、智能人工氣候箱、立式壓力蒸汽滅菌器、堿式滴定管、Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)等。主要試劑：羧甲基纖維素鈉、橄欖油、聚乙烯醇、碘伏、剛果紅、溴甲酚紫、L-酪氨酸、福林、三氯乙酸、可溶性淀粉、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸(DNS)等。

1.3方法

1.3.1酶液的制備 從篩選培養(yǎng)基上挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株于5 mL LB液體中，37℃、110 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，10 000 r/min離心10 min使菌體沉淀得到酶液。

1.3.2平板透明圈法 參照薛志靜等[7]和高繪菊等[8]。記錄篩選培養(yǎng)基中透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)，通過(guò)比較D/d的值來(lái)判斷菌株產(chǎn)酶能力大小，該值越大，菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.3.3分光光度計(jì)法

1.3.3.1蛋白酶活性的測(cè)定 采用福林-酚法[9-10]。首先制作酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。以酪素作為酶的底物，測(cè)定管中加入酶液，對(duì)照管中加入煮沸15 min的酶液，使酶失活，加入底物，37℃水浴20 min，加入三氯乙酸終止反應(yīng)，然后1 000 r/min離心，去除沉淀，取上清液于另一試管，加入福林試劑和碳酸鈉混勻，37℃水浴顯色15 min，在波長(zhǎng)680 nm處進(jìn)行比色，以對(duì)照管調(diào)零，讀取測(cè)定管的吸光度值。從繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出酪氨酸的濃度，求出蛋白酶活性值。蛋白酶活性單位定義：在37℃條件下，每毫升酶液1分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸的濃度。蛋白酶活性=c/(t·v)，式中c為酪氨酸的濃度(μg/mL)，t為反應(yīng)時(shí)間，v為酶液體積。

1.3.3.2淀粉酶活性的測(cè)定 采用淀粉-碘法[9-10]。首先制作可溶性淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。以可溶性淀粉作為反應(yīng)底物，測(cè)定管中加入酶液，37℃水浴預(yù)熱5 min，再加入碘應(yīng)用液，37℃水浴10 min，蒸餾水稀釋至50 mL。對(duì)照組不加酶液，混勻。在波長(zhǎng)660 nm處進(jìn)行比色，以對(duì)照管調(diào)零，讀取測(cè)定管吸光度值。淀粉酶活性單位定義：在37℃條件下，每毫升酶液1分鐘內(nèi)水解淀粉后剩余的可溶性淀粉的濃度。淀粉酶活性=c/(t·v)，式中c為可溶性淀粉的濃度(μg/mL)，t為反應(yīng)時(shí)間，v為酶液體積。

1.3.3.3纖維素酶活性的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸法[9-10]。首先制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。以羧甲基纖維素鈉作為反應(yīng)底物，測(cè)定管中加入酶液，對(duì)照管中加入煮沸15 min的酶液，37℃水浴恒溫糖化30 min，取出立即水浴煮沸15 min，終止反應(yīng)。然后加入DNS顯色液，水浴中煮沸顯色15 min后，冷卻至室溫，再加蒸餾水定容至25 mL，混勻。以對(duì)照管調(diào)零，在波長(zhǎng)540 nm處進(jìn)行比色。纖維素酶活性單位定義：在37℃條件下，每毫升酶液1分鐘內(nèi)水解CMC產(chǎn)生的葡萄糖的濃度。纖維素酶活性=c/(t·v)，式中c為葡萄糖的濃度(μg/mL)，t為反應(yīng)時(shí)間，v為酶液體積。

1.3.3.4脂肪酶活性的測(cè)定 采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[9]。以聚乙烯醇橄欖油乳化液作為反應(yīng)底物，對(duì)照管中加入95%乙醇，測(cè)定管和對(duì)照管分別加入酶液，37℃水浴20 min，用95%乙醇終止反應(yīng)。再加1%酚酞指示劑，用0.05 M標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至微紅色，記錄滴定用去NaOH溶液的體積。脂肪酶活性單位定義：在37℃條件下，每分鐘內(nèi)每毫升酶液滴定消耗的NaOH溶液的體積。脂肪酶活性=(A-B)/(t·v)，式中A為樣品耗堿液體積(mL)，B為對(duì)照組耗堿液體積(mL)，t為反應(yīng)時(shí)間，v為酶液體積。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同生態(tài)環(huán)境中的銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性進(jìn)行方差分析，并根據(jù)方差分析的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)兩種方法測(cè)得的不同生境中銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1蛋白酶活性 經(jīng)過(guò)方差分析，平板透明圈法測(cè)得的不同生境蛋白酶活性之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=1.089，P=0.415>0.05；福林-酚法測(cè)得的各菌株的蛋白酶活性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=461.565，P<0.05，其中粘質(zhì)沙雷菌、霍氏腸桿菌和蠟樣芽胞桿菌的產(chǎn)蛋白酶活性顯著高于其他幾種產(chǎn)蛋白酶菌株(表1)。因此，測(cè)定產(chǎn)蛋白酶菌株的產(chǎn)酶活性，福林-酚法的靈敏度要優(yōu)于平板透明圈法。同時(shí)，不管是在花生田還是廢棄菜園銅綠麗金龜幼蟲體內(nèi)分離到細(xì)菌的蛋白酶活性，福林-酚法得到數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均低于平板透明圈法，說(shuō)明福林-酚法的可重復(fù)性和精密度更好(表2)。

表1 兩種不同生境中銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶活性比較

注：同一列字母相同，表明方差分析在0.05水平上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩種方法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶活性變異系數(shù)分析

2.2淀粉酶活性 經(jīng)過(guò)方差分析，平板透明圈法測(cè)得的菌株的淀粉酶活性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.4963，P=0.5200)；淀粉-碘法測(cè)得的菌株產(chǎn)淀粉酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.349，P=0.003)，其中蠟樣芽胞桿菌的淀粉酶活性顯著高于多食鞘氨醇桿菌(表3)，說(shuō)明淀粉-碘法的靈敏度要優(yōu)于平板透明圈法。測(cè)定不同生態(tài)環(huán)境銅綠麗金龜幼蟲體內(nèi)分離到細(xì)菌的蛋白酶活性時(shí)，淀粉-碘法得到數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均低于平板透明圈法，說(shuō)明淀粉-碘法的可重復(fù)性和精密度更好(表4)。

表3 兩種不同生境中銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌的產(chǎn)淀粉酶活性比較

注：a表示兩數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=42.349，P=0.003。

表4 兩種方法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶活性變異系數(shù)分析

2.3纖維素酶活性 經(jīng)過(guò)方差分析，平板透明圈法測(cè)得的各菌株的纖維素酶活性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.5721，P=0.011)，其中粘質(zhì)沙雷菌的產(chǎn)酶活性顯著高于其他菌株；3,5-二硝基水楊酸法測(cè)得的各菌種的纖維素酶活性之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.7673，P=0.005)，其中多食鞘氨醇桿菌和粘質(zhì)沙雷菌的產(chǎn)纖維素酶活性顯著高于其他菌株，說(shuō)明3,5-二硝基水楊酸法的靈敏度要高于平板透明圈法(表5)。同時(shí)，3,5-二硝基水楊酸法得到數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均低于平板透明圈法，說(shuō)明3,5-二硝基水楊酸法的可重復(fù)性和精密度更好(表6)。

表5 兩種不同生境中銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌的產(chǎn)淀粉酶活性比較

注：同一列字母相同者表明方差分析在0.05水平上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示兩數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4脂肪酶活性 產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌僅分離自廢棄菜園的銅綠麗金龜幼蟲體內(nèi)，菌株為非脫羧勒克菌。分別用平板透明圈法和聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測(cè)定了其產(chǎn)脂肪酶活性。結(jié)果表明，聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法比平板透明圈法的變異系數(shù)大，說(shuō)明該方法精密度較低(表7)。測(cè)定腸道細(xì)菌脂肪酶活性的首選方法是平板透明圈法。

3 討 論

3.1結(jié)果分析與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究比較 銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌可以分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等多種酶類消化食物。一般認(rèn)為，動(dòng)物體內(nèi)消化酶活力的高低可以直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收能力，并與攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)類型及含量有關(guān)[11]。比較不同生境的消化酶活性可知，廢棄菜園的野生蠐螬蛋白酶活性比花生田高，可能是由于野生蠐螬以腐殖質(zhì)為主要食物來(lái)源，為有效降解土壤中的蛋白質(zhì)，其腸道細(xì)菌的產(chǎn)蛋白酶活性較高；而花生田的蠐螬產(chǎn)纖維素酶的活性比廢棄的菜園高，可能是由于花生田中蠐螬多以取食花生的根為生，需要降解其中大量的纖維素，因此其腸道中細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活性較高。本研究采用兩種方法測(cè)定銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌的產(chǎn)消化酶活性，通過(guò)結(jié)果分析可知，測(cè)定銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌的產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性時(shí)最好選擇分光光度計(jì)法，而在測(cè)定脂肪酶活性時(shí)，首選平板透明圈法。國(guó)內(nèi)外對(duì)蠐螬腸道細(xì)菌的組成已有研究[4,7,12-15]，且部分研究也關(guān)注到其腸道中產(chǎn)纖維素酶的共生細(xì)菌[12]，但這些研究均未涉及到腸道細(xì)菌產(chǎn)消化酶的活性研究，無(wú)法篩選出高產(chǎn)酶活性的菌株。

表6 兩種方法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活性變異系數(shù)分析

表7 兩種方法測(cè)定非脫羧勒克菌的脂肪酶活性

3.2研究的意義與不足 昆蟲腸道共生細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性的研究多以平板透明圈法為主，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，易于操作，但精度較低；以分光光度計(jì)法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性，靈敏度高，但操作復(fù)雜，受儀器限制較多。本研究以銅綠麗金龜幼蟲腸道細(xì)菌為研究對(duì)象，比較了兩種方法在測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性方面的優(yōu)劣，得到了適用于不同消化酶細(xì)菌活性測(cè)定的方法。在此基礎(chǔ)上，比較了不同細(xì)菌的產(chǎn)酶活性，篩選出高產(chǎn)酶活性菌株，這些菌株可用于功能性微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)，既可用于特種動(dòng)物飼料加工，還可用于農(nóng)業(yè)廢棄物的快速發(fā)酵，提高廢棄物的利用效率[12]。

但由于分光光度計(jì)法和平板透明圈法均難以實(shí)現(xiàn)高通量，篩選過(guò)程中仍未建立大規(guī)模的快速篩選，因此還需要進(jìn)一步探索高通量測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)消化酶活性的新方法。

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