曲春娟 朱悅，2 江晨 曲明靜 王向譽(yù) 李曉

（1. 山東省花生研究所，青島 266100；2. 塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院，阿拉爾 843300；3. 山東省蠶業(yè)研究所，煙臺(tái) 264000）

銅綠麗金龜Anomala corpulenta隸屬于鞘翅目Coleoptera 多食亞目Polyphaga 金龜總科Scarabaeoidea金龜科Scarabaeidae 麗金龜亞科Rutelinae，在我國(guó)及日本、朝鮮、東南亞等國(guó)廣泛分布，其幼蟲(chóng)危害玉米、花生、大豆、小麥等多種作物根系或莢果，造成直接或間接經(jīng)濟(jì)損失，成蟲(chóng)經(jīng)常聚集暴食葉片，危害榆樹(shù)、楊樹(shù)、葡萄等多種林果木［1-2］，對(duì)其全面深入的研究對(duì)農(nóng)林生產(chǎn)具有重要意義。

麗金龜亞科昆蟲(chóng)全世界已知有235 屬4 200 余種，其中有許多種類是重要的農(nóng)林害蟲(chóng)［3］。目前麗金龜亞科的系統(tǒng)發(fā)育研究主要是納入在金龜總科和金龜科的研究中，針對(duì)麗金龜?shù)难芯縿t相對(duì)缺乏。而且尚有諸多問(wèn)題需要解決，比如麗金龜亞科的單系性有待明確、麗金龜外部形態(tài)趨同現(xiàn)象普遍導(dǎo)致的近緣種區(qū)分困難等［4］。隨著分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因序列被廣泛應(yīng)用到昆蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中。相比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)手段，基因序列在解決趨同進(jìn)化問(wèn)題方面更有優(yōu)勢(shì)。尤其是線粒體基因因其母系遺傳、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，在這一領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［5-6］。對(duì)于金龜總科的分子系統(tǒng)學(xué)研究，過(guò)去主要借助于線粒體單基因、單個(gè)核基因或者少數(shù)2-3 個(gè)基因的聯(lián)合，例如cox1、cox2、16S rRNA、12S rRNA、cytb、nad1等線粒體基因都是經(jīng)常用于進(jìn)化分析的分子靶標(biāo)［7］。然而單個(gè)基因不僅所包含的進(jìn)化信息較少，難以完全解析物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在選擇壓力和進(jìn)化速率方面也存在差異，容易導(dǎo)致“長(zhǎng)枝吸引”等問(wèn)題，而完整的線粒體基因組能夠克服上述弊端，成為研究后生動(dòng)物進(jìn)化歷史和親緣關(guān)系更加強(qiáng)有力的工具［8-9］。以前傳統(tǒng)的線粒體基因組測(cè)序主要依賴于通用引物和長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增，效率低下，費(fèi)事費(fèi)力；尤其是控制區(qū)高AT含量、連續(xù)重復(fù)堿基較多的特點(diǎn)，導(dǎo)致Sanger 測(cè)序獲取全長(zhǎng)序列比較困難。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，該策略被逐步應(yīng)用到線粒體基因組測(cè)序中來(lái)，成為獲取線粒體基因組序列的更有力手段［10］。

目前已完成線粒體全基因組測(cè)序的麗金龜只有日本弧麗金龜Popillia japonica［11］、棉花弧麗金龜Popillia mutans［12］和墨綠彩麗金龜Mimela splendens（MZ064554）。此外還有非全長(zhǎng)序列JX412777（Popilliasp.）和JX412788（Adoretussp.）。其中僅弧麗金龜屬Popillia兩個(gè)種的線粒體基因組是基于高通量測(cè)序組裝獲得。而異麗金龜屬Anomala的線粒體基因組卻未見(jiàn)報(bào)道。該屬是麗金龜亞科中種類豐富度最高的屬，已記錄的超過(guò)1 000 種［4］。其中的代表性物種之一——銅綠麗金龜是我國(guó)華北農(nóng)田三大優(yōu)勢(shì)金龜甲之一［13-14］，受到昆蟲(chóng)學(xué)家及植保工作者密切關(guān)注。針對(duì)其開(kāi)展線粒體全基因組的研究，不僅可以豐富金龜科尤其是麗金龜亞科昆蟲(chóng)的線粒體基因組信息，而且能夠?yàn)殂~綠麗金龜?shù)姆肿酉到y(tǒng)學(xué)、群體遺傳學(xué)及分子生態(tài)學(xué)研究提供重要的基礎(chǔ)信息。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)Illumina 平臺(tái)對(duì)銅綠麗金龜進(jìn)行線粒體基因組測(cè)序，完成組裝和注釋后，對(duì)其線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和基因排列、堿基組成、密碼子使用情況，以及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）的結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)合已發(fā)表的金龜科線粒體基因組序列對(duì)金龜科各亞科、屬和種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為麗金龜?shù)南到y(tǒng)發(fā)育研究和線粒體基因組學(xué)研究提供方法參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試銅綠麗金龜成蟲(chóng)于2020年7月采自山東省花生研究所萊西望城試驗(yàn)基地，將活體試蟲(chóng)放入無(wú)水乙醇中于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。選擇試蟲(chóng)胸部和足的肌肉組織提取基因組總DNA，所用提取方法為改進(jìn)的CTAB 法，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀NanoDrop 2000 分別測(cè)定提取DNA 的質(zhì)量和濃度。

1.2 方法

1.2.1 Illumina HiSeq 高通量測(cè)序 DNA 樣品送至武漢百奧維凡生物科技有限公司構(gòu)建350 bp 的小片段測(cè)序文庫(kù)和進(jìn)行高通量測(cè)序。基于邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis, SBS）技術(shù)和Illumina HiSeq X 測(cè)序平臺(tái)對(duì)所構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行雙端150 bp 測(cè)序，利用NGS QC Toolkit 2.3.3［15］將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除adapter 序列、低質(zhì)量末端、含N>10%的reads 以及長(zhǎng)度小于25 bp 的短片段后，得到11.29 Gb 的clean reads。

1.2.2 序列拼裝、注釋及特征分析 利用SPAdes v3.11.1（http://cab.spbu.ru/software/spades/）［16］拼 接軟件對(duì)clean reads 進(jìn)行拼接，構(gòu)建contigs。使用SSPACE 軟件［17］對(duì)contigs 進(jìn)行擴(kuò)展延伸，獲得最終的完整線粒體基因組序列。利用MITOS 在線服務(wù)器（http://mitos.Bioinf.uni-leipzig.de）［18］對(duì)線粒體基因組序列進(jìn)行功能注釋。并進(jìn)一步通過(guò)與已知金龜科物種的線粒體基因進(jìn)行同源比對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行核對(duì)驗(yàn)證。利用tRNAscan-SE 軟件（http:∥lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）［19］對(duì)tRNA 基因進(jìn)行查找及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。利用Mega 11［20］分別計(jì)算銅綠麗金龜線粒體基因組中各編碼基因的堿基組成、密碼子使用頻率、AT-skew 和GC-skew。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 為研究銅綠麗金龜在金龜科的系統(tǒng)發(fā)育地位，利用線粒體基因組的13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（protein-coding genes，PCGs）的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。選取已報(bào)道的19 種金龜科昆蟲(chóng)的線粒體基因組作為參考序列，以牙甲科昆蟲(chóng)Sphaeridium bipustulatum為外群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和貝葉斯法（Bayesian，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用Clustal X 2.0［21］對(duì)核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)后，使用Gblocks v0.91b［22］過(guò)濾比對(duì)結(jié)果，然后采用SequenceMatrix v1.7［23］對(duì)每個(gè)基因的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行串聯(lián)連接?；赟MS 軟件［24］和ModelFinder［25］對(duì)建樹(shù)數(shù)據(jù)集評(píng)估得到的最適替代模型為GTR+I+G。以PhyML3.0 在線分析軟件［26］進(jìn)行1 000 次bootstrap 運(yùn)算，構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用MrBayes 3 軟件［27］計(jì)算200 000 代，每運(yùn)算100 代取樣保存，舍棄25%的老化樣本，構(gòu)建BI 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。最后使用FigTree v.1.4.3（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 銅綠麗金龜mtDNA基因組結(jié)構(gòu)組成和分布特征

銅綠麗金龜線粒體基因組全長(zhǎng)16 673 bp（GenBank 登錄號(hào)：OL449520），呈現(xiàn)典型雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括13 個(gè)PCGs、2 個(gè)rRNA、22 個(gè)tRNA 共37 個(gè)基因以及1 074 bp 的AT 富集區(qū)，與后生動(dòng)物線粒體基因組的經(jīng)典基因組成一致。昆蟲(chóng)線粒體基因組的多數(shù)基因在同一條鏈上編碼，該鏈稱為J 鏈（majority strand）；其余少數(shù)基因在另一條鏈上編碼，該鏈稱為N 鏈（minority strand）。對(duì)銅綠麗金龜線粒體而言，23 個(gè)基因位于J 鏈上，包括9 個(gè)PCGs（nad3、cox3、atp6、atp8、cox2、cox1、nad2、cytb和nad6）和14 個(gè)tRNA 基因；14 個(gè)基因位于N鏈，包括4 個(gè)PCGs（nad5、nad4、nad4l和nad1）、8 個(gè)tRNA 基因和2 個(gè)rRNA 基因（圖1）。與其他昆蟲(chóng)線粒體一樣，銅綠麗金龜線粒體基因組也存在基因重疊和間隔現(xiàn)象，表現(xiàn)為30 處長(zhǎng)度1-41 bp 的堿基重疊現(xiàn)象和5 處長(zhǎng)度1-15 bp 的堿基間隔現(xiàn)象（表1）。基因排布與已報(bào)道的其他麗金龜：墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜一致，與果蠅代表的祖先模式也一致。

表1 銅綠麗金龜線粒體基因位置與起始終止密碼子Table 1 Locations and start/stop codons of mitochondrial genes in A. corpulenta

圖1 銅綠麗金龜線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Mitochondrial genome structure of A. corpulenta

2.2 線粒體基因組堿基組成

總的來(lái)看，銅綠麗金龜線粒體基因組中A+T 含量占比75.87%，G+C 含量占比24.13%，表現(xiàn)出明顯的AT 偏向性。其中PCGs、tRNA 基因和rRNA 基因的A+T 含量分別為74.87%、76.54%和75.79%。全基因組的AT-skew 為正值（0.027），GC-skew 為負(fù)值（-0.237），表明整個(gè)基因組更偏好于使用A 堿基和C 堿基。整個(gè)線粒體基因組不同位置對(duì)堿基偏好性具有一定差異。22 個(gè)tRNA 基因和2 個(gè)rRNA 的AT-skew 均為正值，表明其偏好A 堿基；13 個(gè)PCGs和2 個(gè)rRNA 的AT-skew 均為負(fù)值，表明其偏好T堿基；從不同的單基因來(lái)看，除atp8外其余12 個(gè)PCGs 的AT-skew 外均為負(fù)值，J 鏈上的9 個(gè)PCGs的GC-skew 均為負(fù)值，N 鏈上的4 個(gè)PCGs 和rRNA基因的GC-skew 均為正值，與大多數(shù)昆蟲(chóng)的線粒體基因組AT/GC 偏斜一致（表2）。

表2 銅綠麗金龜線粒體基因組堿基組成Table 2 Base composition in the mitochondrial genome of A. corpulenta

2.3 線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因及密碼子使用情況

銅綠麗金龜線粒體基因組含有13 個(gè)PCGs，序列全長(zhǎng)11 212 bp（占比67.25%），除去終止密碼子（37 bp）共編碼3 725 個(gè)氨基酸殘基。使用最頻繁的密碼子為UUU（Phe）、UUA（Leu）、AUU（Ile）和UAU（Tyr），而CGC（Arg）、CGG（Arg）、CCG（Pro）和GCG（Ala）使用相對(duì)較少（表3），由此也反映了核苷酸組成的AT 偏好性。

表3 銅綠麗金龜線粒體基因組相對(duì)同義密碼子使用頻率（RSCU）Table 3 Relative synonymous codon usage（RSCU）in the mitochondrial genome of A. corpulenta

所有PCGs中nad5最長(zhǎng)（1 717 bp），atp8最短（157 bp）。除nad4l以TTG 為起始密碼子外，其余PCGs都以ATN 作為起始密碼子，其中nad2、cox3、nad4和cytb以ATG 為起始密碼子，atp6和nad1以ATA為起始密碼子，cox1、atp8和nad5以ATT 為起始密碼子，cox2、nad3和nad6以ATC 為起始密碼子。cox3和nad4以不完整的TA 為終止密碼子，缺失的核苷酸由轉(zhuǎn)錄后3 苷端多聚腺苷酸化補(bǔ)齊［28］，其余PCGs 均以TAA 或TAG 為終止密碼子，與昆蟲(chóng)線粒體基因組普遍使用的終止密碼子一致。

2.4 線粒體基因組tRNA和rRNA

銅綠麗金龜?shù)?2 個(gè)tRNA 基因長(zhǎng)度范圍為63 bp（tRNACys）到72 bp（tRNALys），總長(zhǎng)度為1 450 bp。預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2 所示，除tRNASer（AGN）缺失DHU 臂外，其余tRNA 序列都可以折疊成典型的三葉草式二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，tRNASer和tRNALeu以雙拷貝形式存在，其余tRNA 基因均僅顯示單拷貝。銅綠麗金龜?shù)膬蓚€(gè)rRNA 基因均在N 鏈上，16S rRNA位 于tRNALeu（CUN）和tRNAVal之 間，長(zhǎng) 度1 350 bp；12S rRNA在tRNAVal和控制區(qū)之間，長(zhǎng)度800 bp。

圖2 銅綠麗金龜線粒體基因組tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Putative secondary structures of tRNAs in the mitochondrial genome of A. corpulenta

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以 牙 甲 科（Sphaeridiinae） 中 的Sphaeridium bipustulatum為外群，使用已報(bào)道的麗金龜亞科（Rutelinae）、金龜亞科（Scarabaeinae）、花金龜亞科（Cetoniinae）、鰓金龜亞科（Melolonthinae）、犀金龜亞科（Dynastinae）、蜉金龜亞科（Aphodiinae）共19 種金龜科昆蟲(chóng)及本研究測(cè)得的銅綠麗金龜線粒體基因組的13 個(gè)PCGs 的核苷酸序列，構(gòu)建金龜科昆蟲(chóng)的ML 和BI 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示兩種建樹(shù)方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致，金龜亞科和蜉金龜亞科聚為1 個(gè)分支，麗金龜、花金龜、犀金龜和鰓金龜亞科聚為1 個(gè)分支，置信值均為100%。除鰓金龜亞科外，各亞科均聚為一支且置信值較高。但與傳統(tǒng)分類不同，鰓金龜亞科的5 個(gè)種并未聚為一個(gè)支系。各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系為（蜉金龜亞科+金龜亞科）+（鰓金龜亞科（花金龜亞科（犀金龜亞科+麗金龜亞科）））（圖3）。

圖3 基于線粒體蛋白質(zhì)編碼基因核苷酸序列構(gòu)建的銅綠麗金龜與其他金龜科昆蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（最大似然法和貝葉斯法）Fig. 3 Phylogenetic tree of A. corpulenta and other insects species of Scarabaeidae based on the mitochondrial protein-coding gene sequences（maximum likelihood and Bayesian）

銅綠麗金龜聚在麗金龜亞科分支系，與墨綠彩麗金龜組成姐妹關(guān)系，且置信值均為100%。利用Kimura-2-Parameter 參數(shù)模型計(jì)算麗金龜亞科5 個(gè)種之間的遺傳距離，結(jié)果所反映的親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致：銅綠麗金龜與墨綠彩麗金龜?shù)倪z傳距離為0.007 9，而與棉花弧麗金龜和日本弧麗金龜?shù)倪z傳距離分別為0.172 7 和0.177 4，與喙麗金龜屬Adoretussp.的遺傳距離則為0.209 9（表4）。

3 討論

線粒體基因組具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率快的特點(diǎn)，作為分子標(biāo)記有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前被廣泛應(yīng)用到遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、生物地理學(xué)以及物種診斷學(xué)等研究領(lǐng)域［5-6］。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的昆蟲(chóng)線粒體基因組完成測(cè)序［5］。這些昆蟲(chóng)線粒體基因組與其他后生動(dòng)物線粒體一樣，呈現(xiàn)共同特點(diǎn)：為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子，長(zhǎng)度為14-20 kb，通常含有37 個(gè)基因，包括13 個(gè)PCGs、22 個(gè)tRNA 基因、2 個(gè)核糖體RNA（ribosomal RNA，sRNA）基因及一個(gè)或數(shù)個(gè)AT 富集區(qū)［29-30］。

本研究首次測(cè)定和分析了銅綠麗金龜?shù)耐暾€粒體基因組，豐富了金龜科的線粒體基因組信息，尤其是為研究異麗金龜Anomala屬在麗亞科中的系統(tǒng)發(fā)育位置提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。銅綠麗金龜線粒體基因組全長(zhǎng)16 673 bp，與NCBI 已公布的其他3 種麗金龜（墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜）的線粒體基因組大小近似（15 148-16 541 bp）［11-12］。包含37 個(gè)線粒體基因，排布方式與上述3 種麗金龜完全一致，而且與果蠅Drosophila yakuba也一致［31］。D. yakuba線粒體的基因排布方式代表了昆蟲(chóng)線粒體基因排布的祖先模式［31］，說(shuō)明銅綠麗金龜線粒體未發(fā)生基因重排現(xiàn)象。

在昆蟲(chóng)綱中，線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因已被廣泛證實(shí)可以有效解決不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題［5］。本研究以線粒體基因組的13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因作為分子靶標(biāo)，探索了金龜科6 個(gè)亞科（麗金龜亞科、金龜亞科、花金龜亞科、鰓金龜亞科、犀金龜亞科、蜉金龜亞科）的分類學(xué)關(guān)系［3］。在已公布線粒體基因組序列的幾種麗金龜物種中，日本弧麗金龜、棉花弧麗金龜和墨綠彩麗金龜具有完整的線粒體基因組序列。Adoretussp.（JX412788）的線粒體基因組雖然是部分序列，但包含了完整的13 個(gè)PCGs 序列信息，因此也被納入到建樹(shù)數(shù)據(jù)集。但Phylloperthasp.（KX087335）和Popilliasp.（JX412777）的線粒體基因組由于缺失部分PCGs的數(shù)據(jù)，未被采用。

Table 4 Pairwise genetic distances of mitochondrial protein-coding gene sequences between A. corpulenta and other phytophagous species of Scarabaeidae based on Kimura-2-Parameters

已知的金龜科昆蟲(chóng)全世界超過(guò)30 000 種，按照食性分為糞食性和植食性兩大類［32-33］。其中糞食類包括金龜亞科和蜉金龜亞科，植食類包括犀金龜、花金龜、麗金龜和鰓金龜。本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也清晰得顯示了金龜科是由這兩個(gè)主要群體構(gòu)成的。植食性金龜子各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系為鰓金龜亞科+（花金龜亞科+（犀金龜亞科+麗金龜亞科）），與Ayivi 等［33］和Song 等［12］基于線粒體基因組ML 樹(shù)和BI 樹(shù)的分析結(jié)果一致。麗金龜亞科和犀金龜亞科互為姐妹群，也與目前多數(shù)學(xué)者基于形態(tài)學(xué)和分子證據(jù)得出的主流觀點(diǎn)一致［4］。此外，麗金龜、犀金龜、花金龜和金龜亞科的單系性均得到很高的支持，說(shuō)明系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可信度較高。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)鰓金龜亞科并非單系群，這與之前報(bào)道一致［12,33-35］。

在屬級(jí)階元關(guān)系上，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果顯示麗金龜亞科一支中，異麗金龜屬Anomala與彩麗金龜屬M(fèi)imela的親緣關(guān)系更近，弧麗金龜屬Popillia次之，而喙麗金龜屬Adoretus較遠(yuǎn)，且在該分支上兩種分析方法的置信值均為100%。遺傳距離分析的結(jié)果同樣證明了上述關(guān)系，支持了Bouchard 等［3］關(guān)于麗金龜亞科的分類系統(tǒng)。但齒爪鰓金龜屬Holotrichia兩個(gè)種（暗黑鰓金龜H. parallela和大黑鰓金龜H.oblita）并沒(méi)有聚到一起，還需要進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)銅綠麗金龜線粒體基因組全序列的測(cè)定，豐富了金龜科線粒體基因組的序列信息以及結(jié)構(gòu)和組成信息，為后續(xù)麗金龜科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為銅綠麗金龜?shù)娜后w遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究提供了基礎(chǔ)信息。

4 結(jié)論

獲得了銅綠麗金龜線粒體全基因組，其基因的排布方式與墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜相同，且與祖先模式一致，系統(tǒng)發(fā)育分析支持麗金龜亞科的單系性，異麗金龜屬Anomala與彩麗金龜屬M(fèi)imela的親緣關(guān)系較其與弧麗金龜Popillia和喙麗金龜屬Adoretus更近。