李旺寧 張豪杰 李亞男 梁夢靜 季春麗 張春輝 李潤植崔玉琳 秦松 崔紅利

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801；2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源保護重點實驗室，煙臺 264003）

光不僅能提供光合作用的驅(qū)動力，其自身蘊含的光信息對植物生長、發(fā)育、代謝及適應環(huán)境均具有重要作用［1］，而且還作為光信號參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個方面，如種子萌發(fā)［2］、器官生長方向［3-4］、葉片和繁殖器官在空間上的排列方式［5］、葉綠體運動［6］及開花時間等［7］。因此，植物進化出一套針對不同波段太陽光并由光受體介導的光感知與信號轉導系統(tǒng)。

光受體是介導植物對光信號作出反應的一類生物大分子物質(zhì)，可以感知光強、波長以及方向等，從而調(diào)控植物作出相應的生理反應，最終引起植物個體表型上的變化［8］。根據(jù)感受不同的光質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的光受體類型包括紅光/遠紅光受體——光敏色素（phytochrome, PHY）、藍光受體——隱花色素（cryptochrome, CRY）、向光素（phototropin, PHOT）和紫外光受體-UV（UV-B）。植物依靠藍光受體隱花色素（CRY）和向光素（PHOT）感知藍光信號，并通過復雜的接收和轉導系統(tǒng)，進而與體內(nèi)其他信號轉導途徑耦聯(lián)，最終調(diào)控藍光響應生理過程，藍光在高等和低等植物生長發(fā)育過程中十分重要，能夠調(diào)控光形態(tài)發(fā)生、葉綠體運動、下胚軸生長、開花時間、生物鐘、生物節(jié)律、趨光性及次級代謝產(chǎn)物的合成等［9］。

隱花色素（CRY）是一類光裂合酶的黃素蛋白，其作用是調(diào)控藍光下一些基因的表達及調(diào)控植物的光形態(tài)建成［10-12］。CRY 蛋白包括N 端光裂合酶同源結構域（photolyase homologous region, PHR）和C 端延伸的羧基端延伸結構域（CRYC-terminal extension, CCE）［13］。PHR 結構域由光裂解酶進化而來氨基酸序列比較保守，負責黃素腺嘌呤核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）和甲基四氫葉酸（N5-methyltetrahydrofolicacid, MTHF）的結合，CCE結構域氨基酸序列多變有很大差異，但具有相同的DAS（DQXVP-Acidic-STAESSS）基序［11］，被認為是光信號傳遞的主要結構域［14］。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有2 個植物類型CRYs（CRY1 和CRY2）、1 個動物類型CRY［15］和1 個DASH（Drosophila、Arabidopsis、Synechocystis和Homo） 類 型CRY［16］。3 種 類 型CRYs 的細胞定位、表達模式、功能及作用機制都不完全相同［17］。

CRY 在真核微藻中分布廣泛，并存在多個基因拷貝。真核微藻來源的CRY 主要包括動物類型（aCRY）、DASH 類型（dashCRY）和植物類型（pCRY）3 大類。在硅藻（Diatom）［18］和褐藻（Brown algae）［19］中發(fā)現(xiàn)了aCRY。海洋來源綠藻（Ostreococcus tauri）中分別發(fā)現(xiàn)了aCRY（OtCPF1）［20］和dashCRY（OtCPF2）［21］，并在另一株海洋綠藻（Ostreococcus lucimarinus）中發(fā)現(xiàn)了5 個編碼CPF 的基因，但這兩株綠藻中都沒有發(fā)現(xiàn)pCRY［21］。據(jù)報道，紅藻（Cyanidioschyzon merolae）［22］和等鞭藻（Isochrysis galbana）［23］中存在pCRY，在團藻（Volvox carteri）和萊茵衣藻中分別發(fā)現(xiàn)了4 個CRYs，1 個植物類型pCRY、1 個動物類型aCRY 和2 個DASH 類型［24-25］。團藻pCRY 在體細胞中大量表達，而在生殖細胞中很少表達［24］。萊茵衣藻中aCRY 不但可以感受藍光信號，同時可以感受部分紅光信號，通過構建萊茵衣藻aCRY 的突變株，發(fā)現(xiàn)細胞周期循環(huán)、節(jié)律調(diào)節(jié)、葉綠素及類胡蘿卜素合成相關基因在轉錄水平上受到其調(diào)控［26］。pCRY 在黑暗下積累，在藍光和紅光條件下通過光依賴性蛋白酶迅速降解，其對藍光響應的光譜特征已經(jīng)在體外進行驗證［24-25,27］。

關于向光素以及aCRY 的突變以及突變之后的表型變化已有文獻報道，但pCRY 還未見報道。結合前人研究，海洋綠藻和淡水綠藻在2 種不同環(huán)境下的諸多生理差異以及不同藻株之間可能存在差異，對不同來源萊茵衣藻及CRY 突變株的表型也有待進一步的研究。

本研究以衣藻野生株CC5325 和突變株crcry為研究對象，對野生株CC5325 和突變株crcry藻株進行比較分析，從生長、色素、光合及油脂合成等方面比較其在正常光照CK（Control）與藍光BL（Blue light）培養(yǎng)條件下的表型差異，以期評估cry在萊茵衣藻藍光響應過程中所發(fā)揮的功能，為進一步生物學功能及調(diào)控機制的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 試驗所用的萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry（Cre.06.g295200）均購自衣藻資源中心［28］，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.1.2 培養(yǎng)條件 藻株培養(yǎng)條件設置為溫度（24±1）℃， 光12 h/ 暗12 h、20 μmol/（m2·s），采用TAP（Tris-Acetate-Phosphate medium）培養(yǎng)基，crcry添加濃度為10 μg/mL 的巴龍霉素培養(yǎng)，每天定時手動搖瓶3-4 次，防止細胞貼壁，培養(yǎng)至藻細胞達到對數(shù)期。搖勻，取CC5325 和crcry各3 mL 至250 mL 錐形瓶中（含100 mL TAP 液體培養(yǎng)基），將裝有CC5325 和crcry的錐形瓶放置黑暗中適應24 h，之后置于CK 條件和BL 條件下，每隔2 d 定時取樣用于各項生理指標的測定。

1.1.3 光質(zhì) 試驗中分別設置正常（白光）和藍光培養(yǎng)條件，以白光作為對照，連續(xù)24 h 光照。采用歐普照明LED 白光和藍光2 種光質(zhì)的燈具（40 W方形30 cm×30 cm，光照強度為1 100 lx，藍光波普范圍550 nm），光源安裝在培養(yǎng)架兩側，每塊LED燈板包括160 個LED 燈。通過移動錐形瓶與LED 燈的距離來調(diào)節(jié)強度，光強使用TES 1332A 勒克斯計測量，在試驗前連續(xù)照射24 h 使系統(tǒng)穩(wěn)定。每組設置3 個重復。

1.2 方法

1.2.1crcry突變體的分子鑒定 收集培養(yǎng)對數(shù)期的藻液離心備用，以CC5325 和crcry基因組DNA 和cDNA 為模板進行PCR。采用CTAB 法提取CC5325和crcry的基因組DNA，根據(jù)ChlaMmeSeq 方法［29］，擴增3 個片段用于測序，以確定crcry的確切插入位點。（1）用基因cry引物F+R 預測插入位點；（2）F+C1（插入盒下游引物）與引物對的5′插入盒基因組連接；（3）（插入盒上游引物）C2+R 與引物對的3′插入盒基因組連接。采用Trizol（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）試劑提取CC5325 和crcry總RNA，參照TaKaRa 公司的試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）將RNA 反 轉 錄 成cDNA，用引物Actin-F+Actin-R 和cry-F+cry-R 驗證。所有用于PCR 鑒定的引物見表1。反應體系如表2所示，反應程序為98℃ 5 min；98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)，每個樣品重復3 次。

表1 引物信息Table 1 Primers information

表2 PCR 反應體系Table 2 PCR reaction system

1.2.2 細胞密度的測定 每天定時吸取10 μL 搖勻的藻液，置于視野為40×10 倍的光學顯微鏡下觀察，采用血球計數(shù)板（25×16 型）對萊茵衣藻細胞進行計數(shù)。

細 胞 密 度（cells·mL-1）=80 小 格 內(nèi) 細 胞 個數(shù)/（80×400×10 000×稀釋倍數(shù)）

1.2.3 單位細胞色素含量的測定 取5 mL 藻液4 500 r/min 離心10 min，棄上清液后向沉淀中加入與藻液等體積的95%乙醇充分混勻，75℃水浴15 min，冷卻后4 500 r/min 離心10 min，用分光光度計測上清液在665、649 和470 nm 的OD 值，根據(jù)公式［30］計算藻細胞中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的濃度Chla、Chlb 和Car（mg/L）含量。

Chla=13.95×OD665-6.88×OD649

Chlb=24.96×OD649-7.32×OD665

Car=（1 000×OD470-2.05×Chla-114.8×Chlb）/245

單位細胞色素含量（ng/cell）＝［色素含量（mg/L）/細胞密度（cells·mL-1）］×107

1.2.4 光合作用活性的測定 使用MINI-PAM-II 葉綠素熒光儀（H. Walz. Effeltrich, Germany）測定藻細胞的光化學活性（光化光設置為72 μmol/（m2·s））。藻液避光暗處理20 min，再檢測光合生理指標的變化。實際光能轉化效率（effective photo-chemical quantum yield of PSII, Y（II））、最大光能轉換效率（maximum photochemical quantum yield of PSII, Fv/Fm）、光化學淬滅系數(shù)（coefficient of photochemical fluorescence quenching, qP） 和非光化學淬滅系數(shù)（non-photochemical quenching, NPQ）。 光 處 理5 min 后測定Y（II）和PAR 值，根據(jù)公式ETR=Y（II）×PAR×0.5×0.84 計算相對電子傳遞速率（electron transport rate, ETR）值。

1.2.5 總脂含量的測定 總脂含量的測定參照邵雪梅［31］方法，稱取冷凍干燥后的藻粉50 mg，每個處理設置3 個生物學重復。藻粉中加入2.5 mL 氯仿、5 mL 甲醇，在37℃搖床中抽提24 h 后離心收集上層有機相，剩余藻粉殘渣重復抽提2 次。合并3 次所得的上層有機相，加入5 mL 氯仿和9 mL 氯化鈉溶液（10 g/L），離心后收集下層有機相到玻璃管中，用氮吹儀吹干樣品至恒重。

總脂含量（%）=（總脂重量/藻粉重量）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 對照組和處理組均設置3 個平行，采用excel（2019）和SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法進行顯著性分析（P<0.05），繪圖采用Origin9 軟件（OriginLab Corporation, USA）。

2 結果

2.1 萊茵衣藻crcry突變體的鑒定

根據(jù)衣藻庫（Clip）（https://www.chlamylibrary）對突變株crcry的描述，cry在其CDS 編碼區(qū)有一個盒反向插入（圖1-a）。為了驗證該插入，分別在DNA 水平和RNA 水平進行驗證。DNA 水平上用3對引物（cry-F+cry-R、cry-F+Cassette-C1 和Cassette-C2+cry-R，引物見表1）進行PCR。F（正向）和R（反向）分別位于假定插入位點的上游和下游，C1（反向）和C2（正向）分別位于盒的3′和5′端（圖1-a）。以CC5325 基因組DNA 為模板，只有F+R 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物（300-400 bp）。相反，以cry基因組DNA 為模板，F(xiàn)+R 沒有產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物，而F+C1 和C2+R 各有一條PCR 產(chǎn)物（F+C1：300-400 bp，C2+R：700-1 000 bp）（圖1-b）。RNA 水平上用引物（Actin-F 與Actin-R 和cry-F 與cry-R，引物見表1）進行PCR，分別以CC5325 和crcry的cDNA 為模板，Actin-F 和Actin-R 各有一條PCR 產(chǎn)物（300-400 bp），cry-F 和cry-R 之間野生株CC5325 有一個PCR 產(chǎn)物（300-400 bp），相反，突變株crcry沒有產(chǎn)生PCR 產(chǎn)物（圖1-c）。表明盒成功插入并且表達。對這兩個PCR 產(chǎn)物進行測序，結果證實該盒以反義方向插入crcry的CDS編碼區(qū)中，保持其完整的5′和3′端（圖1-a）。

對野生株CC5325 和突變株crcry進行固體平板以及液體篩選驗證。萊茵衣藻CC5325 不具有巴龍霉素抗性，在含10 μg/mL 巴龍霉素的TAP 篩選平板上不能生長；突變株crcry有巴龍霉素抗性基因，能夠在含巴龍霉素的篩選平板上正常生長。將CC5325和crcry涂布于含有巴龍霉素的TAP 固體平板上（圖1-d），弱光培養(yǎng)一周左右，可以看出CC5325 在含有巴龍霉素的平板上變白，而crcry生長出綠色單藻落。之后在含有巴龍霉素的TAP 液體培養(yǎng)體系中再次進行驗證（圖1-e），與圖1-d 結果相同，CC5325 藻株在含有巴龍霉素的培養(yǎng)基中不能生長，但crcry能夠正常生長。以上結果證明crcry突變株中AphVIII抗性基因成功表達，隨后在TAP 液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

圖1 萊茵衣藻crcry 突變體的鑒定Fig.1 Identification of C. Reinhardtii crcry mutant

2.2 藍光對萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry生長的影響

用細胞密度來表示萊茵衣藻的生長情況。從圖2 可以看出，正常光與藍光條件下CC5325 存在差異，且在藍光條件下生長較快。2 種光照條件下，crcry生長存在很大差異，藍光下crcry生長明顯受到抑制。隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞密度均在第6 天達到最大，CK-CC5325、CK-crcry、BL-CC5325 和BL-crcry的細胞數(shù)分別為2.124×107、2.249×107、2.423×107和1.563×107cells·mL-1，藍光下CC5325 細胞數(shù)目是正常光下的1.14 倍，crcry是0.69 倍（圖2）。培養(yǎng)到第8 天，正常光照條件下，CC5325 與crcry顏色差異不顯著，較前期相比，藻液顏色變黃；藍光條件下，CC5325 與crcry顏色差異較顯著，CC5325長勢比crcry好。在正常光與藍光條件下，CC5325差異不顯著，crcry差異顯著，藍光條件下crcry顏色較黃。結果表明，正常光對衣藻CC5325 和crcry影響不大，然而藍光條件對衣藻CC5325 和crcry影響較明顯。

圖2 藍光對萊茵衣藻CC5325 和crcry 生長的影響Fig. 2 Effects of blue light on the growth of C. reinhardtii CC5325 and crcry

2.3 藍光對萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry單位細胞色素的影響

由圖3 可知，藍光輻射對萊茵衣藻單位細胞內(nèi)色素的積累影響較大，且影響效果與處理時間有關。無論在正常光還是藍光條件下，CC5325 與crcry的單位細胞色素含量前期均呈上升趨勢，后期趨于平緩乃至降低。培養(yǎng)至第4 天，CC5325 與crcry在正常光下顏色差異不明顯，但在藍光下差異非常顯著。CC5325 與crcry的單位細胞葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量均無明顯差異。藍光下crcry顯著低于CC5325，其單位細胞葉綠素a 的含量為3.92×10-4ng/cell（圖3-a）、葉綠素b 為2.26×10-4ng/cell（圖3-b）、總 葉 綠 素 為6.12×10-4ng/cell（圖3-c），與CC5325 相比，crcry的葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素分別下降了48.97%、64.53%和67.44%。在正常光下單位細胞中類胡蘿卜素差異不顯著，但在藍光下，crcry中類胡蘿卜素顯著高于CC5325，含量為1.97×10-4ng/cell（圖3-d），與CC5325 相比，增高了65.27%。單位細胞總色素在正常光下也沒有差異，在藍光下差異顯著，CC5325 與crcry細胞中總色素含量分別為11.44×10-4和7.95×10-4ng/cell（圖3-e），與CC5325 相比，crcry降低30.65%。單位細胞總色素的含量取決于總葉綠素和類胡蘿卜素，盡管crcry類胡蘿卜素含量高，但由于葉綠素含量所占的比例較大，所以crcry總色素仍然低于CC5325。正常光下類胡蘿卜素與總葉綠素的比值隨著培養(yǎng)時間的延長變化不顯著，與正常光相比，藍光下的野生株CC5325 顯著降低，然而突變株crcry相反，顯著高于正常光及藍光下的CC5325（圖3-f）。色素含量均在第6 天得到積累達到峰值，隨后降低。

圖3 藍光對萊茵衣藻CC5325 和crcry 單位細胞色素的影響Fig. 3 Effects of blue light on the single cell pigments of C. reinhardtii CC5325 and crcry

以上結果表明，正常光條件對CC5325 和crcry的色素含量影響不明顯，藍光條件對CC5325 和crcry色素含量影響較大。且藍光條件能夠促進CC5325 色素的積累，不利于突變株crcry色素的積累，尤其是葉綠素。

2.4 藍光對萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry光合作用的影響

實際光化學效率Y（II）表示用于光化學反應的能量。從圖4-a 中可以看出，Y（II）隨著培養(yǎng)時間的增加呈先上升再下降的趨勢，在第4 天達到最大，第6-8 天逐漸趨于穩(wěn)定。正常光和藍光條件下，CC5325 與crcry之間差異不明顯，但藍光條件下，Y（II）低于正常光條件。說明藍光能夠影響PSII 的光合性能。

最大光化學效率（Fv/Fm）用來表示植物潛在的最大光合活性（圖4-b）。萊茵衣藻的Fv/Fm 受環(huán)境中光質(zhì)的影響，在不同光質(zhì)下，萊茵衣藻Fv/Fm 隨培養(yǎng)時間增加均呈下降趨勢，其中，藍光的影響最大，尤其是對突變株crcry。Fv/Fm<0.6 表明藻細胞受到抑制，正常光條件下，培養(yǎng)至第3 天后，開始抑制藻細胞生長；而在藍光條件下，培養(yǎng)1 d 已開始抑制細胞生長，并且藻細胞受到的抑制隨培養(yǎng)時間延長而加強，藍光影響更顯著。

相對電子傳遞速率（rETR）可以用來反映植物對光強的耐受能力（圖4-c）。萊茵衣藻的相對電子傳遞速率（rETR）隨著培養(yǎng)時間的增加先升高后下降，培養(yǎng)到第4 天，相對電子傳遞速率（rETR）達到最大，隨后呈下降趨勢。且藍光下rETR 低于正常光條件，CC5325 與crcry相比較，在受到強光輻射后rETR 降低更快。crcry中細胞的光保護受損使ETR 降低，表明CRY 是這種藻類光保護的中心角色。

非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）表示將過剩的光能以熱的形式耗散掉的能力（圖4-d）。在此過程中NPQ 都相應的增加，并且在第4 天達到最大值，表明在此條件下已發(fā)生熱耗散，但隨著處理時間的增加，NPQ 恢復到正常狀態(tài)。NPQ 在CC5325 與crcry之間存在差異，藍光條件下明顯低于正常光條件。這表明在短期內(nèi)藍光可使萊茵衣藻產(chǎn)生脅迫誘導，但隨著時間的延長，衣藻能夠適應不同光質(zhì)的環(huán)境。

光化學淬滅系數(shù)（qP）反映了PSII 反應中心的開放程度（圖4-e）。白光及藍光條件下，qP 先上升后下降，同樣在第4 天達到最大，之后4-8 d 趨于穩(wěn)定。CC5325 與crcry之間的qP 存在差異，藍光條件下略低于正常光條件。

圖4 藍光對萊茵衣藻CC5325 和crcry 光合作用的影響Fig. 4 Effects of blue light on the photosynthesis of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

2.5 藍光對萊茵衣藻野生株CC5325和突變株crcry總脂的影響

培養(yǎng)結束時（第8 天），檢測在正常光和藍光條件下衣藻CC5325 和crcry的總脂含量（圖5）發(fā)現(xiàn)，正常光條件下，CC5325 與crcry的總脂差異不顯著，含量分別是38.16%和38.74%；藍光條件下，CC5325 與crcry總脂差異明顯，含量分別是42.15%和15.96%。相比于正常光，藍光能促進CC5325 總脂積累，增加了12.34%；而抑制crcry總脂積累，下降了58.80%。表明藍光有利于萊茵衣藻中總脂的積累，但不利于隱花色素破壞型的突變株中總脂的積累。

圖5 藍光對萊茵衣藻CC5325 和crcry 總脂的影響Fig. 5 Effects of blue light on the total lipid of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

3 討論

植物通過光受體介導的信號轉導途徑響應光信號。藍光受體隱花色素能感知藍光信號，在植物的藍光響應中發(fā)揮重要的作用。隱花色素基因在擬南芥中被克隆以后，在番茄、蕨類以及苔蘚乃至人體中都進行了相關研究［32-34］。研究表明，擬南芥中CRY1 和CRY2 對光形態(tài)建成起著重要的調(diào)控作用，其中，CRY1 在藍光下主要抑制下胚軸的伸長，CRY2 主要控制光周期調(diào)控開花。

藍光對微藻的生長具有顯著的影響。Das 等［35］研究發(fā)現(xiàn)藍光下微擬球藻（Vannochloropsissp）的比生長率有所提高，Gon?alves 等［36］發(fā)現(xiàn)藍光有利于Tetradesmussp. 的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常光培養(yǎng)條件相比，CC5325 在藍光下的生長較快，而突變株crcry的生長受到明顯抑制，暗示cry在該藻株的生長過程中發(fā)揮重要作用。

藍光對微藻新陳代謝的影響較大，有研究表明紅光會引起細胞損傷，而藍光能夠明顯提高藻類光合色素的含量［37］。本研究結果表明，藍光下CC5325 葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及總色素含量高于正常光，這與沈銀武等［38］研究結果一致，藍光對中華植生藻中葉綠素b 和類胡蘿卜素合成有促進作用。crcry在藍光下的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及總色素含量均低于CC5325。同時發(fā)現(xiàn)正常光下，CC5325 與crcry類胡蘿卜素的含量差異不明顯；在藍光下兩者之間類胡蘿卜素差異非常顯著，crcry顯著高于CC5325，而Im 等［39］研究發(fā)現(xiàn)，暴露于連續(xù)低強度藍光可提高LHCBM6、GSAT 和PDS 轉錄水平，但在突變株（Ri20, PHOT 水平<10%的野生類型藻株）中的轉錄水平較野生株（CC-124）相比積累較少，造成這一現(xiàn)象的原因可能是藍光強度差異以及突變株的不同。本研究發(fā)現(xiàn)正常光條件下，CC5325 及crcry的類胡蘿卜素比葉綠素的比值相對穩(wěn)定；藍光條件下，CC5325 類胡蘿卜素比葉綠素的比值略微降低，crcry恰恰相反，顯著升高。暗示藻細胞在不同光質(zhì)條件下，類胡蘿卜素比葉綠素的比值變化，是響應光質(zhì)很重要的一個指標，進一步證明萊茵衣藻在藍光的響應過程中，cry介導調(diào)控了葉綠素與類胡蘿卜素的合成，來導致比率的變化，進而響應藍光光質(zhì)。

光質(zhì)可以對植物的生長、品質(zhì)及產(chǎn)量產(chǎn)生影響，這與光質(zhì)可調(diào)控植物的光合作用密切相關［40］。結合葉綠素熒光曲線圖和具體參數(shù)，發(fā)現(xiàn)藍光輻射引起了PSII 反應中心的變化。本研究通過葉綠素熒光參數(shù)來反映不同光質(zhì)（正常光、藍光）下萊茵衣藻的光合性能發(fā)現(xiàn)，藍光下藻細胞Y（II）、Fv/Fm、rETR、NPQ 和qP 值均低于正常光，且藍光下crcry低于CC5325。Y（II）實際光化學效率前期呈上升趨勢，第4 天達到最大，之后下降至穩(wěn)定；Fv/Fm 均呈下降趨勢，該結果與前人對斜生柵藻（Scenedesmus obliqnusFACHB-1986）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的研究結果相類似［41］；rETR 也是先上升后下降，藍光下低于正常光，推測可能在這種條件下，更多的光能可能用于類胡蘿卜素的合成；NPQ 均低于正常光,這與高光下結果相一致，表明過量的光能超過藻細胞自身的承受能力,不能以熱的形式耗散掉；qP 的變化趨勢NPQ 幾乎是一致的，均先上升后下降。

藍光是促進微藻細胞積累關鍵產(chǎn)物的有效刺激因子，同時對油脂的積累也有非常重要的影響。周玉嬌等［42］研究表明，小球藻突變株油脂含量與野生型相比有所提高。本研究亦發(fā)現(xiàn)正常光下突變株crcry總脂稍高于野生株CC5325；相反，藍光下crcry總脂含量遠低于CC5325。同時，與正常光相比，藍光促進了CC5325 藻細胞中油脂的積累，這與小球藻［43］、微擬球藻［44］和雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）［45］等微藻積累油脂結果一致；藍光抑制了crcry中油脂的積累，Beel 等［26］發(fā)現(xiàn)藍光條件下aCRY 突變體中的大多數(shù)與代謝相關的基因，以及編碼細胞周期成分的基因都受到aCRY 調(diào)節(jié)。本研究推測，藍光條件下crcry含量較低可能與油脂代謝相關基因受pCRY 調(diào)節(jié)相關，由于基因片段插入cry，導致該基因在轉錄水平上中斷，從而不能響應藍光輻射，因此藍光下crcry中油脂含量比較低。

4 結論

crcry表現(xiàn)出生長差、顏色黃、類胡蘿卜素含量增高、葉綠素、光合指標及總脂降低。cry參與了萊茵衣藻藍光響應的過程。