劉紅菊， 屯妮薩·麥提賽伊迪， 張仕琦， 楊開倫

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830052）

我國(guó)小麥種植面積大，每年小麥秸稈達(dá)到了1.4 億噸，（高振華和邸明偉，2008；李堅(jiān)，2008）。但大量的小麥秸稈以燃燒以及填埋的方式處理，造成環(huán)境嚴(yán)重污染。將小麥秸稈作為粗飼料飼喂反芻動(dòng)物，不僅提高了小麥秸稈的有效利用率，還可以解決畜牧業(yè)飼草料緊缺的問(wèn)題（Wei等，2009）。但是，小麥秸稈纖維含量高，纖維素達(dá)到了41.00%，半纖維素達(dá)到了32.51%，木質(zhì)素達(dá)到了15.40%（Lv等，2016），作為反芻動(dòng)物粗飼料，其適口性差，消化率、利用率低，導(dǎo)致其潛能未被開發(fā)出來(lái)（王炫清等，2017）。因此，如何降低小麥秸稈中木質(zhì)纖維素含量，提高反芻動(dòng)物對(duì)小麥秸稈的利用率具有重要意義。目前，小麥秸稈作為粗飼料的主要處理方法有物理法、化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。物理處理時(shí)間短、無(wú)污染且可提高小麥秸稈適口性，但耗能較大，成本較高，不適于大規(guī)模處理（盧松，2010）?；瘜W(xué)法處理時(shí)間短，秸稈利用率高，但成本高且易造成二次環(huán)境污染。微生物處理小麥秸稈是在秸稈中加入有益微生物，微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，其相互作用，可以降低粗纖維的含量，從而可以提高其作為粗飼料的利用價(jià)值。研究顯示，秸稈經(jīng)食用真菌發(fā)酵后，對(duì)秸稈的木質(zhì)纖維具有較好的降解能力，可有效降解木質(zhì)素，保留纖維素并降低干物質(zhì)損失率。張榮等（2015）研究表明，利用Trichoderma asperellum1285發(fā)酵麥秸10 d后，半纖維素和木質(zhì)素的損失率分別為23.22%、18.01%。糙皮側(cè)耳菌株是擔(dān)子菌門下傘菌目側(cè)耳科一種類，是我國(guó)廣泛栽培的食用菌，以農(nóng)作物秸稈（棉花秸稈、稻草、小麥秸稈等）為底物培養(yǎng)食用菌，采摘子實(shí)體后測(cè)得秸稈中纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含量降低，氮含量增加。本試驗(yàn)首先液體培養(yǎng)糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）615 菌株，研究其產(chǎn)漆酶、錳過(guò)氧化物酶的能力；其次利用菌液固體發(fā)酵經(jīng)1.00%CaO處理的小麥秸稈，測(cè)定發(fā)酵后小麥秸稈中粗蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量變化，探究糙皮側(cè)耳615對(duì)小麥秸稈木質(zhì)纖維素的降解效果，為豐富小麥秸稈微生物處理技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）的配制：去皮馬鈴薯200.00 g切成薄片放入裝有1.00 L去離子水的燒杯中煮沸30 min，用8層紗布將馬鈴薯淀粉液濾出，加入葡萄糖20.00 g、KH2PO43.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、 維生素 B11.00 g 攪拌，溶解，將配制好的PD培養(yǎng)液分裝到三角錐瓶中，塞棉塞，并包報(bào)紙2層，線繩扎緊，進(jìn)行121℃高壓滅菌20 min，冷卻后測(cè)得pH為6.0，備用。

1.2 菌種來(lái)源 糙皮側(cè)耳 （Pleurotus ostreatus）615菌株購(gòu)于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所。

1.3 種子液的制備 將備用PD培養(yǎng)液分別倒入3個(gè)250 mL三角錐瓶中各100.00 mL，并接入糙皮側(cè)耳615菌株1.00 g，放入水浴搖床恒溫振蕩器，溫度設(shè)為25℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng) 5 d，每天觀察菌球生長(zhǎng)情況。制得種子液，放4℃冰箱，備用。

1.4 粗酶液的制備 將100.00 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻后接入5 d菌齡的糙皮側(cè)耳615菌株種子液10.00 mL，做3個(gè)重復(fù)，放入水浴搖床恒溫振蕩器中，溫度設(shè)為25℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)10 d。每天取培養(yǎng)液2.00 mL至離心管中，離心（4℃，6000 r/min）10 min，用移液槍吸取上清液于離心管中冷凍（-20℃），保存，直至取到第10天為止。該粗酶液用于測(cè)定漆酶、錳過(guò)氧化物酶1～10 d的酶活力變化。

1.5 漆酶活力測(cè)定 用ABTS的氧化來(lái)表示漆酶的活性。其1.50 mL反應(yīng)體系為：吸取濃度為2.50 mmol/L的2,2-聯(lián)氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）500.00μL和濃度為0.10 mol/L的醋酸鈉緩沖液 （pH=4.5）900.00μL，加入100.00μL粗酶液，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)5 min內(nèi)420 nm處吸光度的變化。以轉(zhuǎn)化1.00μmol ABTS所需的酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（1.00μmol/min）。

1.6 錳過(guò)氧化物酶活力測(cè)定 用MnSO4的氧化來(lái)表示錳過(guò)氧化物酶的活性。其1.41 mL反應(yīng)體系為：吸取濃度為1.43 mmol/L的硫酸錳溶液（即用濃度為 50.00 mmol/L，pH=4.5酸-乳酸鈉鹽緩沖液配置MnSO4溶液）1.35 mL和濃度為0.08 mol/L的H2O2溶液0.05 mL，加入0.05 mL粗酶液，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)5 min內(nèi)270 nm處吸光度的變化。每分鐘使1.00 mmol/L的Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的錳過(guò)氧化物酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（1.00 μmol/min）。

1.7 糙皮側(cè)耳615菌株固體發(fā)酵小麥秸稈 稱取100.00 g小麥秸稈原料（粉碎至40目）放入燒杯中，在燒杯中加入1.00%的CaO及100.00 mL去離子水，用玻璃棒攪拌均勻后靜置24 h。將靜置24 h的小麥秸稈裝袋并放入121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，滅菌結(jié)束后放在超凈工作臺(tái)中冷卻，待接種。試驗(yàn)分為三組分別為空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，空白組為未處理的小麥秸稈原樣，對(duì)照組為經(jīng)1.00%CaO處理靜置24 h的小麥秸稈，試驗(yàn)組為經(jīng)1.00%CaO處理靜置24 h后接種10%糙皮側(cè)耳615菌株種子液的小麥秸稈。

在超凈工作臺(tái)中利用糙皮側(cè)耳615菌株種子液接種冷卻后的小麥秸稈樣品，接種量為10.00%，將接種后的小麥秸稈樣品25℃發(fā)酵30 d，每日觀察發(fā)酵情況。

1.8 糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵小麥秸稈30 d后飼料常規(guī)成分的測(cè)定 未處理的小麥秸稈原樣、經(jīng)1.00%CaO處理靜置24 h的小麥秸稈、糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵小麥秸稈樣品干物質(zhì)的測(cè)定采用GB/T6435-2006飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量采用美國(guó)ANKOM纖維分析儀進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算出纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量及降解率，蛋白質(zhì)采用快速定氮儀測(cè)定。

1.9 掃描電鏡分析 將待掃描小麥秸稈樣品用導(dǎo)電膠帶固定在銅臺(tái)上，噴金后用日立新型高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡SU8010掃描電子顯微鏡觀察。掃描電鏡分析小麥秸稈試樣為未粉碎樣。

1.10 數(shù)據(jù)計(jì)算及處理 試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）程序進(jìn)行方差分析，各組間平均值的多重比較采用Duncan法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙皮側(cè)耳615菌株種子液形態(tài)與顯微觀察糙皮側(cè)耳615菌株液體培養(yǎng)5 d后出現(xiàn)小米粒大小的淡黃色小菌球。糙皮側(cè)耳615菌株顯微鏡下菌絲的結(jié)構(gòu)有橫隔和分枝，有鎖狀聯(lián)合，菌絲粗細(xì)較均勻，較細(xì)胞狹長(zhǎng)（王茂成，2013）。

2.2 漆酶活力測(cè)定 由圖1可知，漆酶活力從第1天～第4天不斷上升，并在第4天達(dá)到最大值1428.00 U/L，漆酶活力從第5天開始下降，且在第10天下降到399.00 U/L。

圖1 1～10 d漆酶活力變化

圖2 1～10 d錳過(guò)氧化物酶活力變化

2.3 錳過(guò)氧化物酶活力測(cè)定 由圖2可知，錳過(guò)氧化物酶活力從第1天至第5天不斷上升，并在第5天達(dá)到最大值15.45 U/L，錳過(guò)氧化物酶活力從第6天開始下降，且在第10天下降到4.74 U/L。2.4 菌株發(fā)酵小麥秸稈30 d后飼料常規(guī)成分的含量 由表1可知，在中性洗滌纖維方面，試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組和空白組（P＜0.05），且分別低了4.23%和4.08，對(duì)照組與空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在酸性洗滌纖維方面，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P ＜ 0.05），極顯著高于空白組（P ＜ 0.01），且分別高了4.19%和7.24%，對(duì)照組顯著高于空白組（P＜0.05），且高了2.93%；在纖維素方面，試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組與空白組 （P＜0.01），且分別高了37.17%、38.87%，對(duì)照組與空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在半纖維素方面，試驗(yàn)組極顯著低于對(duì)照組與空白組 （P＜0.01），且分別降低了19.87%、20.89%，對(duì)照組與空白組無(wú)顯著性差異；在木質(zhì)素方面，試驗(yàn)組極顯著低于對(duì)照組與空白組（P ＜ 0.01），且分別降低了 43.75%、57.01%，對(duì)照組與空白組差異顯著 （P＜0.05），且比空白組低23.57%；在粗蛋白質(zhì)方面，試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組與空白組 （P＜0.01），且分別提高了4.14%、3.91%，對(duì)照組與空白組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵小麥秸稈30 d后對(duì)飼料常規(guī)成分含量的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）%

2.5 小麥秸稈掃描電鏡結(jié)構(gòu)變化分析 小麥秸稈原樣、1.00%CaO處理后小麥秸稈、糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵后小麥秸稈掃描電鏡圖分別見(jiàn)圖3、圖4，圖5。圖3所示在放大5000倍的情況下可以清楚地顯示小麥秸稈原料表面光滑平整，結(jié)構(gòu)致密有規(guī)則。圖4所示經(jīng)1.00%CaO處理后的小麥秸稈表面蠟質(zhì)層遭到破壞，使得小麥秸稈表面出現(xiàn)裂痕。圖5所示糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）615菌株發(fā)酵后小麥秸稈表面出現(xiàn)大量密集孔洞、細(xì)絲及膨松狀態(tài)片狀結(jié)構(gòu)。

圖3 小麥秸稈原樣掃描電鏡圖（左：外側(cè) 右：內(nèi)側(cè)5000×）

圖4 1.00%CaO處理后小麥秸稈掃描電鏡圖（左：外側(cè) 右：內(nèi)側(cè)5000×）

圖5 糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）615菌株固態(tài)發(fā)酵30 d的小麥秸稈掃描電鏡圖（左：外側(cè) 右：內(nèi)側(cè) 5000×）

3 討論

3.1 糙皮側(cè)耳615菌株液體培養(yǎng)1～10 d過(guò)程中漆酶、錳過(guò)氧化物酶活力的變化 漆酶和錳過(guò)氧化物酶是秸稈中粗纖維降解的關(guān)鍵酶，主要產(chǎn)生于真菌。在真菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量的漆酶與錳過(guò)氧化物酶。木質(zhì)素的降解主要由漆酶與錳過(guò)氧化物酶參與完成。首先，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)在酶的催化作用下發(fā)生單電子氧化反應(yīng)形成苯氧自由基；其次，木質(zhì)素的降解產(chǎn)物被菌絲體吸收，進(jìn)一步被氧化成二氧化碳和水，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素的降解。因此，提高漆酶與錳過(guò)氧化物酶的活力，是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素降解的主要手段。本試驗(yàn)使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)糙皮側(cè)耳615菌株，培養(yǎng)液中漆酶和錳過(guò)氧化物酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間先升后降。漆酶在培養(yǎng)的第4天活性達(dá)到最高，活力為1428.00 U/L，此后漆酶的活力呈下降趨勢(shì)，至第10天活力與培養(yǎng)初接近，與范文霞等（2008）以毛云芝菌為菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)（PD）的結(jié)果一致，其研究培養(yǎng)到第4天時(shí)漆酶的活力達(dá)到最高水平，為582 U/mL，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其酶活逐漸降低。本試驗(yàn)中漆酶活力比范文霞等試驗(yàn)結(jié)果中漆酶活力高59.24%，可能因?yàn)榫N不同其產(chǎn)酶能力也不同。

池玉杰等（2009）研究表明，在紅平菇降解木質(zhì)素試驗(yàn)中以木屑為產(chǎn)酶底物，測(cè)得錳過(guò)氧化物酶在第11天達(dá)到最高，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。而范鵬珍等（2011）研究也表明，在含Mn2+的LNAS培養(yǎng)基中不加底物條件下培養(yǎng)菌株可檢測(cè)到含量較低的錳過(guò)氧化物酶，但產(chǎn)酶最佳時(shí)間為第13天，出現(xiàn)延后。本試驗(yàn)錳過(guò)氧化物酶在培養(yǎng)的第5天活性達(dá)到最高，活力為15.45 U/L，此后酶活開始降低。與池玉杰、范鵬珍等結(jié)果相比較，本試驗(yàn)錳過(guò)氧化物酶活性到達(dá)最高值的時(shí)間明顯縮短，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與試驗(yàn)培養(yǎng)基、添加的底物以及菌種有關(guān)。池玉杰（2009）在培養(yǎng)菌種過(guò)程中以木屑為底物，可能因?yàn)榫N生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生錳過(guò)氧化物酶用來(lái)降解木屑中的粗纖維而被消耗，直至粗纖維降解結(jié)束，才使得錳過(guò)氧化物酶活性在第13天達(dá)到最大值。在未添加底物條件下，范鵬珍（2011）研究利用低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基 （LNAS）培養(yǎng)杏鮑菇和乳白耙齒菌，LNAS培養(yǎng)基除了含有KH2PO4和MgSO4以外，還含有CaCl2等礦物質(zhì)溶液，該培養(yǎng)基pH為4.5，本試驗(yàn)PD培養(yǎng)基主要含有馬鈴薯淀粉、葡糖糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4等，且 pH 為 6.0。 因此，培養(yǎng)基的成分不同、pH不同導(dǎo)致范鵬珍等研究產(chǎn)酶時(shí)間與本試驗(yàn)產(chǎn)酶時(shí)間不同。在本試驗(yàn)培養(yǎng)條件下，使用糙皮側(cè)耳615菌株作為菌種，以PD作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基可以縮短產(chǎn)生錳過(guò)氧化物酶的時(shí)間。研究表明，在偏堿性培養(yǎng)基中真菌產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶的活力更高（李旭東等，2006）。本試驗(yàn)在PD培養(yǎng)基內(nèi)添加維生素B1，維生素B1可提高培養(yǎng)基pH，可能是使錳過(guò)氧化物酶活力達(dá)最高值時(shí)間縮短的原因。

3.2 糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵小麥秸稈30 d后對(duì)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化的影響 小麥秸稈粗纖維含量高（60%以上），粗蛋白質(zhì)含量低（3% ～6%）（魏敏，2002）且適口性差，作為粗飼料不能被完全消化，利用率低。目前小麥秸稈作為粗飼料飼喂家畜的方式為直接飼喂或加工成顆粒飼喂，顆粒飼喂方法雖然提高了采食量，但利用率仍然很低（哈麗代·熱合木江等，2014）。因此，小麥秸稈作為粗飼料的有效利用，一是要提高動(dòng)物對(duì)小麥秸稈的采食量，二是要提高小麥秸稈中木質(zhì)纖維素的消化率。

提高小麥秸稈中木質(zhì)纖維素 （特別是木質(zhì)素）的降解率是提高小麥秸稈消化利用的關(guān)鍵。木質(zhì)纖維素的降解主要是通過(guò)多種纖維降解酶協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究顯示，將真菌接種到棉花秸稈（Shi等，2008）、玉米秸稈（侯進(jìn)等，2010）、稻草秸稈（李燕榮，2010）），其分泌的超纖維氧化酶可溶解秸稈表面的蠟質(zhì)，并吸附在木質(zhì)纖維素的端部，然后，菌絲由端部向內(nèi)延伸，并產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、內(nèi)切聚糖酶和外切聚糖酶將秸稈降解為小分子碳源和半纖維素，為菌絲的生長(zhǎng)和木質(zhì)素的降解提供碳源和能量（鄧緣，2005；Hadar等，1992）。

張榮等 （2015）研究發(fā)現(xiàn)，T.asperellum1285菌株發(fā)酵麥秸8 d后纖維素、半纖維素分別降低了9.94%、18.58%。T.asperellum1285菌株發(fā)酵麥秸10 d后半纖維素和木質(zhì)素的分別降低了23.22%、18.01%。本試驗(yàn)糙皮側(cè)耳615菌株固態(tài)發(fā)酵小麥秸稈30 d后其中性洗滌纖維、半纖維素和木質(zhì)素分別降低了4.23%、19.87%和43.75%，而小麥秸稈酸酸性洗滌纖維和纖維素含量分別升高了4.19%和37.17%。本試驗(yàn)半纖維素、木質(zhì)素降解率明顯高于張榮等（2015）研究結(jié)果，纖維素降解率低于其結(jié)果?？赡茉蚴菑垬s等發(fā)酵麥秸時(shí)間與本試驗(yàn)不同，本試驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間較張榮等發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，使得半纖維素、木質(zhì)素被降解的徹底。侯進(jìn)等（2010）應(yīng)用白腐真菌發(fā)酵曲種發(fā)酵玉米秸稈結(jié)果顯示，中性洗滌纖維含量升高，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相同。由于菌種不同導(dǎo)致其對(duì)纖維素降解能力也不同，且小麥秸稈品種和收獲時(shí)期等不同，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量有差異 （朱順國(guó)等，2001）。Hadar等（1992）研究發(fā)現(xiàn)，平菇發(fā)酵棉籽殼三周時(shí)，降解木質(zhì)素作用深入到密集組織中；隨后，植物的木髓部分逐漸被分離出來(lái)，導(dǎo)管處的細(xì)胞也開始被降解，第四周發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在體外的降解速率逐漸加快，含量明顯降低，所以本試驗(yàn)中半纖維素及木質(zhì)素比張榮等第8天、第10天的降解率高。此外，通過(guò)電鏡掃描經(jīng)糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵后的小麥秸稈，發(fā)現(xiàn)其表面覆蓋的一層蠟質(zhì)層遭到破壞，菌絲直接進(jìn)入小麥秸稈內(nèi)部分泌漆酶、錳過(guò)氧化物酶，這兩種酶相互作用對(duì)內(nèi)部纖維素、半纖維素及木質(zhì)素進(jìn)行降解，使得小麥秸稈被分解成膨松狀態(tài)的片狀結(jié)構(gòu)。此結(jié)果進(jìn)一步證明了糙皮側(cè)耳615菌株可降低小麥秸稈中纖維含量。Arora（1995）和Asiegbu等（1996）研究表明，由于白腐真菌不同菌種的生理差異，具有不同的木質(zhì)素降解酶系，對(duì)粗纖維的降解能力也不同。李野等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，高效降解秸稈木質(zhì)素的4株側(cè)耳屬食用菌類固體發(fā)酵小麥秸稈30 d后小麥秸稈中蛋白質(zhì)含量顯著增加了11.22%。本試驗(yàn)通過(guò)糙皮側(cè)耳615菌株發(fā)酵小麥秸稈30 d后粗蛋白質(zhì)增加了4.14%，蛋白質(zhì)的增加量顯著低于李野等研究結(jié)果?？赡芘c處理所用的菌種、發(fā)酵條件等有關(guān)，因?yàn)榫N不同、發(fā)酵條件不同，發(fā)酵菌的生長(zhǎng)量也不同。

4 結(jié)論

4.1 糙皮側(cè)耳615菌株液體培養(yǎng)過(guò)程中，漆酶在第4天達(dá)到最大值1428.00 U/L，錳過(guò)氧化物酶第5天達(dá)到最大值15.45 U/L。

4.2 小麥秸稈經(jīng)糙皮側(cè)耳615菌株固體發(fā)酵30 d后，小麥秸稈中的木質(zhì)素含量、半纖維素含量均顯著降低，粗蛋白質(zhì)含量顯著升高。

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