楊如鏡 潘婷 林麗娜 黃曉帆 吳淑卿 王興玲

由卵巢腫瘤、性腺發(fā)育不全等導(dǎo)致的卵巢功能衰竭成為輔助生殖技術(shù)最大難題。2004年，Johnson等首次提出卵巢中存在生殖干細(xì)胞[1]，隨后證實(shí)了出生后的小鼠卵巢中存在卵母細(xì)胞和卵泡的更新[2]。其他研究者也分別分離、培養(yǎng)了新生及成年小鼠，以及人的卵巢干細(xì)胞（Germline stem cells）[3-5]。這些發(fā)現(xiàn)為卵巢衰竭患者帶來(lái)了新的希望。組織工程技術(shù)再生卵巢是利用卵巢來(lái)源的細(xì)胞、生物材料及組織工程技術(shù)構(gòu)建人工卵巢，移植入體內(nèi)，達(dá)到提高這些患者生活質(zhì)量如內(nèi)分泌激素分泌或最終生殖能力的改善等目的[6-7]。用于再生醫(yī)學(xué)的生物材料有多種，筆者使用明膠海綿作為支架，種植標(biāo)記來(lái)源于小鼠卵巢的細(xì)胞，初步探討卵巢細(xì)胞移植后存活情況，觀察明膠海綿體內(nèi)降解情況，以期為今后構(gòu)建人工卵巢提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用8～12周SPF級(jí)KM雌鼠，購(gòu)于汕頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在溫度22～25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗的環(huán)境中。

1.1.2 生物材料支架 可吸收Ⅰ型膠原海綿（typeⅠ absorbable collagen sponge，Integra Lifesciences，美國(guó)）。

1.1.3 熒光標(biāo)記物 CellTrackerTMCM-DiI（Invitrogen，美國(guó)），儲(chǔ)存液配制：用二甲基亞砜（DMSO）配制為2 mg/mL，分裝后保存于-20 ℃，避免反復(fù)凍融。工作液配制：使用前用PBS配制，濃度為1 μM。

1.1.4 消化酶 用不含血清的DMEM/F12配制終濃度為 3 mg/mLⅠ型膠原酶（typeⅠ collagenase，sigma，美國(guó)）及 4 mg/mL 中性蛋白酶（dispase，sigma，美國(guó)），分裝后-20 ℃?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。

1.2 方法

1.2.1 卵巢細(xì)胞分離 取6只雌鼠，脫頸椎處死，75%酒精消毒腹部皮膚后剪開(kāi)皮膚及腹腔，找到輸卵管及卵巢，在體視顯微鏡下分離出卵巢，盡量去除卵巢周?chē)闹炯敖Y(jié)蹄組織，換干凈培養(yǎng)皿，用無(wú)菌眼科剪碎后加消化酶。37 ℃孵育30 min后，過(guò)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)（BD，美國(guó)），離心，洗滌。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及熒光標(biāo)記 分離的細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12（Gibco 低糖，美國(guó)）24孔板中，放入6%CO2培養(yǎng)箱。24 h細(xì)胞貼壁后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至3 d準(zhǔn)備熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記物采用 CellTrackerTMCM-DiI（invitrogen，美國(guó)）。貼壁細(xì)胞用 PBS洗滌后，加入 0.5 mL CM-DiI工作液，37 ℃孵育5 min，然后放入碎冰上繼續(xù)孵育15～20 min。去除染色液，用 PBS洗滌 2次后，加入新鮮培養(yǎng)液放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。不同時(shí)間熒光顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)標(biāo)記細(xì)胞比例。培養(yǎng)的標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：選擇培養(yǎng)孔中不同區(qū)域熒光顯微鏡計(jì)數(shù)標(biāo)記細(xì)胞，然后去除培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后加入 1 μg/mL DAPI（Sigma，美國(guó)）染色 5～10 min，熒光顯微鏡計(jì)數(shù)同樣區(qū)域的細(xì)胞核。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)最少計(jì)數(shù)3孔、5個(gè)區(qū)域細(xì)胞，計(jì)算平均值。新鮮分離懸浮細(xì)胞熒光標(biāo)記：取12只雌鼠，分離卵巢組織，剪碎的組織酶消化、離心、PBS洗滌后，加入CM-DiI工作液0.5～1.0 mL至每個(gè)離心管中，37 ℃水浴孵育5 min，然后離心管放入碎冰中繼續(xù)孵育15～20 min，離心去除染色液，PBS洗滌2次后，懸浮于少量培養(yǎng)液（細(xì)胞終濃度為5×106/mL）中待用。

1.2.3 構(gòu)建移植體及小鼠皮下移植 膠原海綿支架用手術(shù)刀切成3×6 mm，放置入干燥的6孔板，200～300 μL熒光標(biāo)記的卵巢細(xì)胞種植于明膠海綿支架中。將種植細(xì)胞的支架放入培養(yǎng)箱2～3 h，等待細(xì)胞黏附于海綿支架。6只8～12周小鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.1 mL，麻醉后腹臥于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒背部皮膚，用手術(shù)剪沿背部正中矢狀線剪開(kāi)皮膚約1 cm，用組織鉗分離皮下組織，取出種植細(xì)胞的移植體，仔細(xì)放入小鼠背部皮下，縫合切口。小鼠放回后觀察復(fù)蘇后活動(dòng)情況。3只小鼠移植后7 d脫頸椎處死，取出移植體，快速冰凍切片、DAPI染液封片，熒光顯微鏡下觀察。3只小鼠移植后3周脫頸椎處死，取出移植體，10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色后顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 卵巢分離細(xì)胞的培養(yǎng) 卵巢分離的細(xì)胞有多種類(lèi)型，如成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及來(lái)源于卵巢皮質(zhì)的生殖干細(xì)胞等。24 h換液后，只有貼壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等可以繼續(xù)生長(zhǎng)，用于觀察細(xì)胞示蹤劑CM-DiI對(duì)卵巢細(xì)胞的標(biāo)記以及熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化。

2.2 培養(yǎng)細(xì)胞的熒光標(biāo)記及動(dòng)態(tài)觀察 CellTrackerTMCM-DiI為DiI衍生物，低細(xì)胞毒性，含有能與硫醇反應(yīng)的氯甲基基團(tuán)，使染料可以共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞硫醇上。這樣，與其他膜染料不同，細(xì)胞在分裂時(shí)熒光染料可以進(jìn)入子細(xì)胞，保持熒光強(qiáng)度達(dá)數(shù)個(gè)細(xì)胞分裂周期，并可在細(xì)胞固定和滲透步驟中保持穩(wěn)定的標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)在標(biāo)記后24 h觀察，98.3%的細(xì)胞被標(biāo)記。培養(yǎng)3 d時(shí)可觀察到個(gè)別細(xì)胞從貼壁變?yōu)閼腋?，以后逐漸增加，懸浮的細(xì)胞熒光信號(hào)逐漸減弱。1周后，熒光標(biāo)記細(xì)胞比例為66.4%，大部分懸浮細(xì)胞熒光信號(hào)消失；培養(yǎng)至2周，幾乎所有細(xì)胞失去熒光信號(hào)。提示用于移植細(xì)胞體內(nèi)示蹤，在短期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（1周內(nèi)）是一種方便使用、熒光信號(hào)較強(qiáng)及可靠的示蹤劑。體外培養(yǎng)細(xì)胞CM-DiI熒光標(biāo)記，見(jiàn)圖1。熒光信號(hào)動(dòng)態(tài)變化，見(jiàn)表1。

圖1 體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞示蹤劑染色（×20）

表1 CM-DiI標(biāo)記卵巢細(xì)胞熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化

2.3 移植體在小鼠體內(nèi)的存活 構(gòu)建的卵巢細(xì)胞-生物支架移植體在植入動(dòng)物體內(nèi)1周后，冰凍切片熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)到大量的移植卵巢細(xì)胞，說(shuō)明膠原海綿支持卵巢細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)。移植3周后，石蠟包埋切片HE染色，可見(jiàn)到膠原海綿支架仍未被降解，細(xì)胞在支架空隙中大量生長(zhǎng)，并有類(lèi)似于血管的結(jié)構(gòu)生成，見(jiàn)圖2。但未發(fā)現(xiàn)典型的卵泡樣結(jié)構(gòu)，可能與筆者分離細(xì)胞時(shí)過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)，原始或竇前卵泡被濾除有關(guān)。

圖2 卵巢細(xì)胞-生物支架動(dòng)物移植3周后移植體內(nèi)細(xì)胞及支架的變化（HE染色，×100）

3 討論

組織工程技術(shù)是近年新興的一門(mén)學(xué)科，是利用生物學(xué)、材料科學(xué)及工程學(xué)原理研發(fā)生物組織器官替代品，達(dá)到恢復(fù)或改善疾病或創(chuàng)傷組織器官的功能及形態(tài)的目的[6-7]。構(gòu)建三維人工卵巢替代卵巢組織冷凍移植，成為恢復(fù)女性內(nèi)分泌及生殖功能的又一選擇[8-9]。筆者用可降解的Ⅰ型膠原海綿作為生物支架，與血纖維蛋白（fibrin）、基質(zhì)膠（matrigel）及水凝膠（hydrogel）相比[10-12]，海綿材料有孔隙，除了可以為卵巢細(xì)胞提供附著支架外，支架中的孔隙還可以為卵巢細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移提供空間，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子及內(nèi)分泌因子的運(yùn)輸以及血管的生成[13-16]。卵巢細(xì)胞用CM-DiI標(biāo)記，體外實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞1周后仍有66.4%的細(xì)胞標(biāo)記，是一種理想的短期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞示蹤劑。體外培養(yǎng)還觀察到，培養(yǎng)1周后發(fā)生部分細(xì)胞脫壁，懸浮在培養(yǎng)液中，可能使細(xì)胞發(fā)生凋亡，這些細(xì)胞熒光信號(hào)也逐漸淬滅，提示對(duì)活細(xì)胞示蹤的影響較小。

體內(nèi)移植組織切片顯示膠原蛋白海綿支持卵巢細(xì)胞生長(zhǎng)，在海綿的孔隙中細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，并發(fā)現(xiàn)類(lèi)似血管樣結(jié)構(gòu)，說(shuō)明所用生物支架具有良好的組織相容性，支持卵巢細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)，可作為今后構(gòu)建人工卵巢的生物材料。

構(gòu)建人工卵巢的巨大挑戰(zhàn)是分離有生殖功能的細(xì)胞，如原始卵泡或卵巢生殖干細(xì)胞。分離原始卵泡構(gòu)建人工卵巢已有多個(gè)研究，與冷凍卵巢組織移植相比，對(duì)卵巢腫瘤患者可降低腫瘤再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[10]。卵巢干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)是可以體外增殖，有望成為恢復(fù)或重建卵巢生殖功能的一個(gè)新的生殖細(xì)胞來(lái)源。本研究也為今后利用組織工程技術(shù)構(gòu)建人工卵巢，治療卵巢早衰提供了一個(gè)新途徑。

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