金嫻 祝玲玲 黃劍 付小義

乙型肝炎是指患者通過(guò)血液、母嬰或者性傳播等方式感染乙肝病毒，臨床檢測(cè)病毒感染陽(yáng)性、伴有乏力、畏食、肝區(qū)疼痛等癥狀的一種疾病[1]，在我國(guó)發(fā)病率極高，其病毒攜帶者占人口總數(shù)近10%[2]。臨床上對(duì)其診斷主要通過(guò)乙肝五項(xiàng)即①乙肝表面抗原（HBsAg）、②乙肝表面抗體（HBsAb）、③乙肝e抗原（HBeAg）、④乙肝e抗體（HBeAb）、⑤乙肝核心抗體（HBcAb）的陽(yáng)性指標(biāo)組合情況和病毒DNA（HBV-DNA）的基因拷貝數(shù)作為診斷病毒感染和繁殖情況的依據(jù)。但由于乙肝五項(xiàng)的不同組合方式極易受治療藥物和病毒變異的影響，且核心抗原在臨床檢測(cè)中不易被檢測(cè)出，因此降低了其判斷乙肝病毒感染和復(fù)制繁殖情況的準(zhǔn)確率[3]。隨著研究的推進(jìn)，前S1抗原（Pre-S1）在臨床上對(duì)乙肝患者的診斷價(jià)值逐步受到人們的重視。前S1抗原是乙肝病毒外膜蛋白的主要成分之一，介導(dǎo)病毒對(duì)肝臟細(xì)胞表面的附著，其在病毒感染、復(fù)制繁殖和刺激免疫反應(yīng)發(fā)生等方面均發(fā)揮著重要作用[4]。而HBV-DNA作為病毒感染和復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)，臨床上用其作為乙肝診斷和判斷疾病情況的有力證據(jù)。為此，本研究旨在分析乙肝五項(xiàng)、病毒前S1抗原及病毒DNA的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷乙型肝炎的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取本院2016年3月-2017年10月接診的301例乙肝患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均符合乙肝的診斷；（2）所有患者均自愿參加研究，并簽署知情同意書(shū)。排除合并腫瘤、心肺等器官功能異常、肝功能障礙和免疫系統(tǒng)缺陷者。其中男174例，女127例，平均年齡（35.6±6.7）歲；乙肝表面抗原陽(yáng)性者289例，陰性者12例。該研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 患者入院后空腹采集靜脈血3 mL，離心5 min后提取上清液于-20 ℃條件下保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA法），按照試劑盒（上?？迫A生物科技有限公司和上海阿爾法生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行嚴(yán)格操作，利用雷杜RT-6000酶標(biāo)儀測(cè)定乙肝五項(xiàng)和病毒前S1抗原水平；按照試劑盒（湖南圣湘生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)，利用美國(guó)ABI公司的ViiA7DX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定乙肝病毒DNA載量。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 判斷標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。病毒前S1抗原的臨界值=2.1×陰性對(duì)照平均OD值，所有陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和樣本的讀數(shù)值減去空白對(duì)照孔讀數(shù)即為計(jì)算值，測(cè)試樣本的計(jì)算值大于或等于臨界值則為陽(yáng)性；測(cè)試標(biāo)本的計(jì)算值小于臨界值為陰性。乙肝表面抗原的臨界值=2×陰性對(duì)照平均OD值，樣本OD值/臨界值≥1者為乙肝表面抗原陽(yáng)性，＜1者為乙肝表面抗原陰性。乙肝表面抗體的臨界值=2.1×陰性對(duì)照平均OD值，樣本OD值/臨界值≥1者為乙肝表面抗體陽(yáng)性，＜1者為乙肝表面抗體陰性。HBeAg的臨界值=2.1×陰性對(duì)照平均OD值，樣本OD值/臨界值≥1者為HBeAg陽(yáng)性，＜1者為HBeAg陰性。乙肝e抗體臨界值=0.2×陰性對(duì)照平均OD值，樣品OD值/臨界值≤1者為乙肝e抗體陽(yáng)性，＞1者為乙肝e抗體陰性。乙肝核心抗體臨界值=0.2×陰性對(duì)照平均OD值，樣品OD值/臨界值≤1者為乙肝核心抗體陽(yáng)性，＞1者為乙肝核心抗體陰性。病毒DNA載量＜1×102IU/mL，則將其判定為乙肝病毒DNA陰性，≥1×102IU/mL則判定為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組合下PreS1Ag陽(yáng)性率與HBV-DNA陽(yáng)性率比較情況 在所有患者中PreS1Ag陽(yáng)性率與HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=29.491，P＜0.05）；①③⑤陽(yáng)性組和①④⑤陽(yáng)性組的PreS1Ag陽(yáng)性率與HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=14.994、17.577，P＜0.05）；①⑤陽(yáng)性組、①②④⑤陽(yáng)性組、①④陽(yáng)性組、①陰性組的PreS1Ag陽(yáng)性率與HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同組合下PreS1Ag陽(yáng)性率與HBV-DNA陽(yáng)性率比較情況

2.2 HBsAg陽(yáng)性及陰性患者的HBeAg、PreS1Ag及HBV-DNA陽(yáng)性率比較 在HBsAg陽(yáng)性組，HBeAg、PreS1Ag和HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=142.187，P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽(yáng)性率低于PreS1Ag陽(yáng)性率和乙肝DNA陽(yáng)性率（ 字2=46.806、141.543，P＜0.05），PreS1Ag陽(yáng)性率顯著低于 HBV-DNA 陽(yáng)性率（ 字2=29.508，P＜0.05）；在HBsAg陰性組，HBeAg陽(yáng)性率及PreS1Ag陽(yáng)性率均為0，HBV-DNA陽(yáng)性率為16.7%。見(jiàn)表2。

表2 HBeAg、PreS1Ag及HBV-DNA檢出率比較

2.3 HBV-DNA陽(yáng)性組和陰性組中HBeAg和PreS1Ag比較 在HBV-DNA陽(yáng)性組中，PreS1Ag的陽(yáng)性率高于HBeAg的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=20.090，P＜0.05）；在 HBV-DNA 陰性組中，HBeAg的陰性率高于PreS1Ag的陰性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=37.792，P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 HBV-DNA陽(yáng)性組和陰性組中HBeAg和PreS1Ag比較

2.4 HBV-DNA不同載量組中HBeAg和PreS1Ag陽(yáng)性率比較 HBV-DNA病毒載量≥1×102IU/mL則判定為陽(yáng)性，在HBV-DNA陽(yáng)性組中，在5×102～1×107隨著病毒載量的增高，HBeAg和前S1抗原陽(yáng)性率均增高，在病毒載量≥108時(shí)，HBeAg和PreS1Ag陽(yáng)性率并未隨著病毒載量的增高而增高，而是表現(xiàn)為下降，見(jiàn)表4。

表4 HBV-DNA不同載量組中HBeAg和PreS1Ag陽(yáng)性率比較

3 討論

乙肝病毒是一種極小的嗜肝DNA病毒，其入侵人體后在肝細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，并通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫使機(jī)體免疫功能紊亂，進(jìn)一步加重病情[5]。臨床上常用檢查的乙肝五項(xiàng)并不是病毒的致病物質(zhì)或者傳染物，即不是活的病毒，因此其并不能量化病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的繁殖情況[6-7]。目前臨床上診斷乙型肝炎常在乙肝五項(xiàng)基礎(chǔ)上配合檢查病毒DNA拷貝數(shù)情況和病毒前S1抗原情況。病毒DNA 是病毒的遺傳物質(zhì)，其在臨床上是判斷病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)，其在臨床經(jīng)常用于對(duì)慢性乙肝進(jìn)行診斷和分類(lèi)、監(jiān)測(cè)治療情況和判斷預(yù)后[8]。S1是乙肝病毒外膜蛋白的成分之一，在病毒入侵肝臟細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，人體在感染乙肝病毒后最早的免疫反映就是針對(duì)病毒前S1抗原的，其出現(xiàn)在病毒感染初期[9]。

本研究結(jié)果顯示，在所有患者中乙肝病毒PreS1Ag陽(yáng)性率和HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），①③⑤陽(yáng)性組和①④⑤陽(yáng)性組的PreS1Ag陽(yáng)性率和HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙肝病毒PreS1Ag與HBV-DNA不具有一致性，這與文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道不一致，考慮是由于病例選擇及使用高靈敏度的乙肝病毒DNA檢測(cè)試劑所致，本研究中有43例患者的HBV-DNA載量在（1～5）×102IU/mL，這在檢測(cè)下限為5×102IU/mL的檢測(cè)試劑中是不能被檢出而被判定為陰性病例，本研究所使用的試劑靈敏度為1×102IU/mL，（1～5）×102IU/mL 的病毒載量也能被檢出，因而HBV-DNA陽(yáng)性率高于PreS1Ag的陽(yáng)性率，兩者不具有一致性。①⑤陽(yáng)性組、①陰性組的HBV-DNA陽(yáng)性率和PreS1Ag陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這與文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道一致，考慮與病例選擇有關(guān)。①④陽(yáng)性組、①②④⑤陽(yáng)性組的HBV-DNA陽(yáng)性率和PreS1Ag陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是這兩種模式少見(jiàn)，因樣本數(shù)較少，HBV-DNA陽(yáng)性率和PreS1Ag陽(yáng)性率關(guān)系需擴(kuò)大樣本深入研究才能明確。在①②④⑤陽(yáng)性組中，雖然出現(xiàn)了“保護(hù)性抗體”，但仍有HBV-DNA及PreS1Ag檢出，說(shuō)明乙肝表面抗體陽(yáng)性并不表示沒(méi)有乙肝病毒復(fù)制或者傳染性消失，也有可能是處于病毒清除過(guò)程中，或者是由于基因突變所致。

在單純對(duì)HBsAg陽(yáng)性和陰性患者比較中發(fā)現(xiàn)，PreS1Ag陽(yáng)性率和HBV-DNA陽(yáng)性率均明顯高于HBeAg陽(yáng)性率（P＜0.05），說(shuō)明了PreS1Ag和HBV-DNA在于乙肝抗原相關(guān)性方面高于HBeAg，也進(jìn)一步證實(shí)了國(guó)內(nèi)外關(guān)于HBeAg確實(shí)是臨床上判斷病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制并具有傳染性的重要血清學(xué)指標(biāo)，但又不能單純以HBeAg陽(yáng)性與否作為判斷HBV感染、傳染性及HBV是否在體內(nèi)復(fù)制的指標(biāo)[13-14]。在以HBV-DNA陽(yáng)性或陰性作為參照的研究中發(fā)現(xiàn)，在HBV-DNA陽(yáng)性患者中，PreS1Ag陽(yáng)性率高于HBeAg陽(yáng)性率（P＜0.05）；在HBV-DNA陰性患者中，HBeAg陰性率高于PreS1Ag陰性率（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明了在乙肝e抗體陽(yáng)性患者血清中，PreS1Ag陽(yáng)性在一定程度上能夠代表病毒DNA的復(fù)制；另外，臨床上對(duì)乙肝患者僅進(jìn)行“乙肝五項(xiàng)”的檢查是不夠的，對(duì)PreS1Ag進(jìn)行檢查能夠彌補(bǔ)由于其他原因如病毒變異導(dǎo)致的HBeAg陰性患者的漏診[15]。同時(shí)文獻(xiàn)[16]研究指出，PreS1Ag主要存在于患者乙肝病毒表面，提示機(jī)體內(nèi)只要有乙肝病毒就會(huì)存在PreS1Ag。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[17]研究認(rèn)為，病毒PreS1Ag能夠加強(qiáng)HBV-DNA和HBeAg臨床檢查的準(zhǔn)確率，并且PreS1Ag出現(xiàn)在病毒感染的最早期，可以用于疾病的早期診斷和傳染源的早期隔離，極大地降低乙型肝炎的傳染性。

另外，在HBV-DNA陽(yáng)性患者血清中，病毒載量在5×102～1×107時(shí)，HBeAg陽(yáng)性率及PreS1Ag陽(yáng)性率隨著病毒載量的增高而增高，這與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[14]研究結(jié)果一致，提示HBeAg及PreS1Ag是病毒復(fù)制的一項(xiàng)重要指標(biāo)，說(shuō)明HBeAg與HBV-DNA在一定程度上具有相關(guān)性，分析其原因可能是在病毒DNA高度復(fù)制，病毒大量繁殖時(shí)，其HBeAg相關(guān)基因高度表達(dá)[18]。HBeAg檢查呈陽(yáng)性說(shuō)明乙肝病毒在體內(nèi)的傳染性較強(qiáng)，而HBeAg轉(zhuǎn)陰在一定程度上提示乙肝病毒的傳染性有下降趨勢(shì)，但并不代表病毒DNA也轉(zhuǎn)陰，仍需加強(qiáng)治療和控制，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[15，19]也證實(shí)了這一點(diǎn)。病毒載量≥108時(shí)，HBeAg陽(yáng)性率及PreS1Ag陽(yáng)性率并未隨著病毒載量的增高而增高，反而表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，考慮是抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中抗原過(guò)剩造成的后帶現(xiàn)象，從而表現(xiàn)為假陰性的結(jié)果，這也是ELISA檢測(cè)方法的局限性。

病毒DNA是判斷病毒是否復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)能夠直接量化病毒載量，其在體內(nèi)消長(zhǎng)情況直接動(dòng)態(tài)反映了病毒復(fù)制情況，并能夠比較直觀地監(jiān)測(cè)治療過(guò)程、判斷抗病毒效果并指導(dǎo)治療方案的制定[16-17]。

綜上所述，在當(dāng)前的檢測(cè)條件下，乙肝五項(xiàng)、PreS1Ag能夠在一定的程度上說(shuō)明乙肝病毒感染和DNA的復(fù)制水平，但是聯(lián)合測(cè)定乙肝五項(xiàng)、PreS1Ag和乙肝病毒DNA水平有利于更早更準(zhǔn)確診斷出乙肝病毒的感染，能夠?yàn)榕R床判斷病情和評(píng)估療效提供參考依據(jù)，并對(duì)疾病的早期診斷和傳染源的早期隔離具有極大的促進(jìn)作用。

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