徐中香，胡 浩，李季楠，吳 艷*

青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook. F.），又稱裸大麥、元麥，禾本科大麥屬，是我國西北高寒地區(qū)極為重要的一種高原谷類作物[1-2]。青稞營養(yǎng)價(jià)值豐富，富含β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）等非淀粉多糖，具有高蛋白質(zhì)、高維生素、高纖維、低糖、低脂等特點(diǎn)[2-3]。AX主要存在于谷物麩皮中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)干基的20%～25%，而胚乳及籽粒中含量相對(duì)較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%～2.5%及4%～8%[4]。麩皮AX因與纖維素、木質(zhì)素等存在共價(jià)結(jié)合[5]，水法提取效果較差，多采用堿法NaOH溶液、飽和Ba(OH)2、Ca(OH)2溶液等提取[6-9]，而使用阿拉伯木聚糖酶法亦可提高AX提取率[6]。李雪等[10]比較了不同堿性提取劑對(duì)小麥麩皮水不溶性AX的提取效果，發(fā)現(xiàn)以NaOH溶液為提取溶劑時(shí)，AX得率雖然不如飽和Ba(OH)2溶液提取得率高，但是提取時(shí)間短、成本低、工藝簡單。Wang Jing等[11]采用超聲波輔助酶法優(yōu)化了小麥麩皮AX的提取工藝，其中得率為14.26%，超聲波提高了酶處理效率，進(jìn)而得率提高。Gong等[12]研究了3 種青稞麩皮中AX質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.21%、18.18%及21.06%，阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值分別為0.83、0.76及0.58。國內(nèi)外對(duì)AX的研究多集中于小麥、大麥及其加工副產(chǎn)物，而對(duì)青稞乃至青稞麩皮AX的研究還較少。

本研究采用堿法提取青稞麩皮AX，研究料液比、提取溫度、提取時(shí)間、NaOH質(zhì)量濃度對(duì)青稞麩皮AX提取的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化AX的最佳提取工藝。采用高效凝膠滲透色譜（high-performance gel permeation chromatography，HPGPC）對(duì)青稞麩皮AX進(jìn)行純度鑒定，紫外吸收光譜、紅外吸收光譜和高效陰離子色譜法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，旨在為青稞麩皮AX的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞麩皮（品種：肚里黃）產(chǎn)地為青海省貴南市，青稞麩皮粉碎后過40 目篩備用。

考馬斯亮藍(lán)試劑盒、耐高溫α-淀粉酶、透析袋上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、乙酸鈉、硝酸鈉、鹽酸、硫酸、苯酚、三氟乙酸、乙醇、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SF-2000高速粉碎機(jī) 上海市藥材有限公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵 上海誠育儀器設(shè)備有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；U1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海恒科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；MDF-U52V超低溫冰箱 日本Sanyo公司；Mili-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；PL203電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ICS-5000離子色譜儀 美國戴安公司；Waters E2695高效液相色譜儀美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞麩皮預(yù)處理

青稞麩皮粉中加入10 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，不斷攪拌，浸泡1 d，除去小分子、低聚糖、揮發(fā)油等物質(zhì)[13]。將除去乙醇的青稞麩皮于60 ℃烘箱中過夜干燥。向脫脂后的青稞麩皮去離子水體系中（料液比1∶10（g/mL））加入耐高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴30 min[14]。60 ℃烘箱中過夜干燥得到脫脂除淀粉的青稞麩皮粉。

1.3.2 堿提工藝

青稞麩皮預(yù)處理粉→加入NaOH溶液→水浴振蕩→離心→等電點(diǎn)除蛋白[15]→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→去離子水透析→乙醇沉淀→離心后水復(fù)溶→冷凍干燥→青稞麩皮AX。

1.3.3 AX得率計(jì)算

采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖的含量[16]，以葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得提取液中多糖含量后，按下式計(jì)算樣品中多糖得率（以預(yù)處理粉計(jì)）：

式中：C為提取液中多糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；m為預(yù)處理粉質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

固定基本提取參數(shù)為料液比1∶15（g/mL）、提取溫度25 ℃、提取時(shí)間2 h、NaOH質(zhì)量濃度10 g/L。在基本提取參數(shù)下，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））、提取溫度（25、35、45、55、65 ℃）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、NaOH質(zhì)量濃度（1、5、10、15、25 g/L）4 個(gè)單因素對(duì)AX得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、NaOH質(zhì)量濃度為自變量，以AX得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理[17]，以青稞麩皮AX得率為指標(biāo)，采用SAS V8.0分析軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)，對(duì)堿法提取AX工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 AX提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table 1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis

1.3.6 青稞麩皮AX純度鑒定

青稞麩皮AX經(jīng)過多次乙醇沉淀后，采用HPGPC法對(duì)其進(jìn)行純度鑒定。色譜條件：Ultrahydrogel liner柱（7.8 mm×300 mm），示差折光檢測(cè)器，柱溫、檢測(cè)器溫度35 ℃，0.10 mol/L NaNO3溶液為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min。流動(dòng)相溶解樣品，配制青稞麩皮AX溶液2 mg/mL，過0.45 μm微孔過濾膜后，供進(jìn)樣分析。

1.3.7 青稞麩皮AX紫外光譜分析

配制青稞麩皮AX溶液0.5 mg/mL，于紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行波長190～400 nm范圍內(nèi)紫外光譜掃描。

1.3.8 青稞麩皮AX紅外光譜分析

將2.0 mg多糖干燥樣品，與200 mg KBr研磨后壓片，在4 000～400 cm－1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.9 青稞麩皮AX單糖組成分析

采用帶有脈沖安培檢測(cè)器的高效離子交換色譜系統(tǒng)測(cè)定單糖組成[18]。取多糖樣品5 mg于具塞管中，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL于121 ℃水解2 h，氮吹除去過量的三氟乙酸，加水溶解定容后過0.45 μm微孔過濾膜，供進(jìn)樣分析[19]。

色譜柱：CarboPac PA20；流動(dòng)相A：H2O；B：250 mmol/L NaOH溶液；C：1 mol/L CH3COONa溶液，三元梯度洗脫程序見表2；流速：0.5 mL/min；積分脈沖安培檢測(cè)器。

表2 AX單糖組成分析梯度淋洗程序Table 2 Gradient elution procedure for monosaccharide composition analysis of AX

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞麩皮AX提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)青稞麩皮AX得率的影響

圖1 料液比對(duì)青稞麩皮AX得率的影響Fig. 1 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of AX

由圖1可知，低溶劑用量時(shí)料液呈糊狀，不利于AX的溶出，因而AX得率較低。隨著溶劑用量的增加，麩皮粉與溶劑充分接觸，加速AX的溶出。料液比1∶20（g/mL）前，AX得率隨著溶劑用量的提高快速增大，料液比1∶20（g/mL）后得率增加趨于平緩，提高不再明顯。鑒于后續(xù)旋蒸濃縮的易操作性及經(jīng)濟(jì)角度，確定最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.2 提取溫度對(duì)青稞麩皮AX得率的影響

圖2 提取溫度對(duì)青稞麩皮AX得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of AX

由圖2可知，青稞AX得率對(duì)提取溫度依賴性較高，提取溫度的升高顯著提高了AX得率，低于55 ℃前隨著溫度的升高得率快速上升，高于55 ℃后得率趨于平緩。雖然較高溫度利于AX的提取，但高溫下得到的AX顏色明顯加深，其中色素等雜質(zhì)較高，不利于后續(xù)的純化，此外，高溫會(huì)導(dǎo)致多糖的降解。因此確定最佳提取溫度為55 ℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)青稞麩皮AX得率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)青稞麩皮AX得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of AX

由圖3可知，提取時(shí)間較短時(shí)，青稞麩皮中的AX尚未充分溶解出來，隨著提取時(shí)間的延長，AX得率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但3 h后增速較慢，漸趨于平緩。因此從提取周期及能耗角度，確定最佳提取時(shí)間為3 h。

2.1.4 NaOH質(zhì)量濃度對(duì)青稞麩皮AX得率的影響

圖4 NaOH質(zhì)量濃度對(duì)青稞麩皮AX得率的影響Fig. 4 Effect of sodium hydroxide concentration on the extraction efficiency of AX

由圖4可知，AX作為植物細(xì)胞壁多糖，不僅與材料中的木質(zhì)素、纖維素等存在復(fù)雜的物理纏繞，與多糖、蛋白質(zhì)之間還存在著以阿魏酰相連的共價(jià)鍵[20]，因而在極低的堿濃度下，絕大部分AX無法溶出，得率極低，這也是AX一般均采用堿提法提取的主要原因。NaOH的質(zhì)量濃度為1～5 g/L時(shí)，AX得率增速較低，質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，得率顯著提高，此后得率有所提高但較平緩。雖然溶劑濃度越大越利于物質(zhì)的溶出，但因麩皮中含有較多色素物質(zhì)，AX得率提高的同時(shí)也伴隨著其他雜質(zhì)（色素、蛋白、木質(zhì)素等）的溶出。因此從后續(xù)除雜及經(jīng)濟(jì)角度，確定最佳NaOH質(zhì)量濃度為15 g/L。

2.2 青稞麩皮AX提取的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，共27 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括24 個(gè)析因試驗(yàn)點(diǎn)，其自變量取值在各因素構(gòu)成三維頂點(diǎn)，3 個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。采用SAS V8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到青稞麩皮AX得率與各變量的二次多項(xiàng)方程的數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=14.256 67＋1.810 833X1＋0.22X2＋0.695X3＋0.269 167X4－2.138 333X12－0.307 083X22－0.932 083X32－0.858 333X42－0.122 5X1X2－0.137 5X1X3＋0.217 5X1X4－0.145X2X3－0.137 5X2X4－0.242 5X3X4。

由表4可知，該回歸模型P值小于0.000 1，說明該模型極顯著，其響應(yīng)值與各試驗(yàn)因素之間存在顯著的線性相關(guān)性；R2值為0.998 3，R2Adj值為0.996 3，說明該模型與試驗(yàn)值擬合較好，能很好地表述青稞麩皮AX提取過程中其得率隨提取條件的變化規(guī)律；失擬項(xiàng)P值為0.332 4，不顯著，同樣確定了模型的可行性；自變量X1、X2、X3、X4的P值均小于0.000 1，說明它們對(duì)AX得率都有極顯著的影響，而據(jù)自變量的F值可判斷各因素對(duì)AX得率的影響由大到小依次為：X1＞X3＞X4＞X2；交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4P值小于0.05，均影響顯著，說明各因素對(duì)AX得率均有顯著的交互作用。

表3 青稞麩皮AX提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表4 響應(yīng)面模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面及等高線圖可分析因素對(duì)AX得率的交互作用并確定最佳提取參數(shù)。等高線形狀可反映各因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反[11]。

圖5 兩因素交互作用對(duì)提取效果影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on extraction efficiency

選取3 組交互作用作響應(yīng)面圖，其他兩因素水平取0。由圖5a可知，AX得率隨著料液比和提取時(shí)間水平的增大而提高，但當(dāng)兩者達(dá)到一定組合后，AX得率趨于平緩，兩者交互作用顯著?？赡苁钱?dāng)料液比和提取時(shí)間達(dá)到一定值后，AX得到了充分提取，再之后水平提高AX得率增加不再顯著。由圖5b可知，在一定范圍內(nèi)，AX得率隨著料液比及NaOH質(zhì)量濃度水平的增加顯著提高，而當(dāng)兩者達(dá)到一定組合后，AX得率隨著組合條件的提高而呈緩慢下降趨勢(shì)?？赡苁沁^高的NaOH質(zhì)量濃度造成了部分多糖的降解。由圖5c可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，AX得率不斷增加，當(dāng)提取時(shí)間超過3.5 h后，AX得率趨于穩(wěn)定；此條件下NaOH質(zhì)量濃度對(duì)AX得率的影響與圖5b類似，兩者交互作用顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的確定及模型驗(yàn)證

回歸模型預(yù)測(cè)的青稞麩皮AX最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶25（g/mL）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間3 h、NaOH質(zhì)量濃度15 g/L，在此條件下，AX得率可達(dá)14.27%。以確定的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3 次青稞麩皮AX提取的平行實(shí)驗(yàn)，得到AX得率平均值為14.31%，接近回歸方程所得AX得率的預(yù)測(cè)值。說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)青稞麩皮AX得率的影響，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 青稞麩皮AX的純度鑒定

HPGPC因其快速、簡便和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，是目前多糖純度鑒定最常用的方法。青稞麩皮AX的高效液相色譜圖如圖6所示，在其純度檢測(cè)中，只有一個(gè)對(duì)稱的信號(hào)峰，可見其均一性較好，可以認(rèn)為該青稞麩皮AX為單一組分的多糖聚合物。

圖6 青稞麩皮AX HPGPC法純度測(cè)定Fig. 6 HPGPC analysis of AX

2.4 青稞麩皮AX的紫外光譜分析

圖7 青稞麩皮AX紫外吸收光譜圖Fig. 7 UV absorption spectrum of AX

由圖7可知，青稞麩皮AX在192 nm波長處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，這是多糖的特征吸收峰，在280 nm波長處有微弱的吸收，說明青稞麩皮AX中含有少量蛋白質(zhì)，而在260 nm波長處無吸收峰，說明該多糖中不含核酸[20]。

2.5 青稞麩皮AX的紅外光譜分析

圖8 青稞麩皮AX紅外吸收光譜圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectrum of AX

由圖8可知，3 429 cm－1處的吸收峰是—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，寬吸收峰說明存在分子內(nèi)和分子間氫鍵；2 927 cm－1處的吸收峰是—CH的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 647 cm－1處的吸收峰是—C＝O的伸縮振動(dòng)；1 448 cm－1、1 399 cm－1處吸收峰是—CH2的變形吸收峰；1 340 cm－1處吸收峰是—CH彎曲振動(dòng)吸收峰；1 038 cm－1處的則是醇羥基—OH的變角振動(dòng)吸收峰。在893 cm－1處存在β-糖苷鍵的特征吸收峰，該多糖結(jié)構(gòu)中存在β-多糖[12,21-24]，在864 cm－1處存在α-糖苷鍵的特征吸收峰，該多糖結(jié)構(gòu)中存在α-多糖[25-26]。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AX結(jié)構(gòu)的主鏈?zhǔn)怯搔?D-吡喃木糖殘基經(jīng)β-（1→4）糖苷鍵連接而成的木聚糖，在C2和C3位β-D-木糖殘基可被α-L-呋喃阿拉伯糖取代，形成多分支結(jié)構(gòu)[27]。說明青稞麩皮中提取的多糖符合AX的結(jié)構(gòu)特征。

2.6 青稞麩皮AX的單糖組成

圖9 AX的高效陰離子交換色譜Fig. 9 High performance anion exchange chromatogram of AX

根據(jù)各單糖標(biāo)樣與多糖樣品的保留時(shí)間確定其單糖的種類，根據(jù)各峰面積計(jì)算樣品中各單糖的物質(zhì)的量比。由圖9可得，青稞麩皮AX主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖4 種單糖組成，單糖對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的量比為11.61∶1∶3.62∶18，可以確定提取的青稞麩皮多糖中主要物質(zhì)為AX，且雜質(zhì)糖含量較低，阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.645。Izydorczyk等[28]對(duì)一種加拿大蠟質(zhì)裸大麥糊粉層組織中AX的研究顯示，阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物質(zhì)的量比為13.43∶1∶12.86∶20.33，阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.66，該實(shí)驗(yàn)中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值與本實(shí)驗(yàn)比值相近，但其中葡萄糖含量較高。Skendi等[29]發(fā)現(xiàn)，小麥中提取的多糖阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在0.57～0.71之間，而Rattan等[30]發(fā)現(xiàn)，小麥粉中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在0.61～0.68之間，可見來源不同時(shí)其值會(huì)有不同。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了料液比、提取溫度、提取時(shí)間及NaOH質(zhì)量濃度4個(gè)影響因素與響應(yīng)值青稞麩皮AX得率相互作用的數(shù)學(xué)模型，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了模擬和預(yù)測(cè)，優(yōu)化后的最佳提取工藝為料液比1∶25（g/mL）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間3 h、NaOH質(zhì)量濃度15 g/L。在此條件下AX得率為14.31%，與理論值14.27%無顯著差異。提取工藝的優(yōu)化為青稞麩皮AX的進(jìn)一步理化研究奠定了基礎(chǔ)。對(duì)青稞麩皮AX的結(jié)構(gòu)做了初步分析，HPGPC結(jié)果表明青稞麩皮AX均一性較好，可認(rèn)為其為單一組分的多糖聚合物；紫外光譜檢測(cè)結(jié)果表明青稞麩皮AX中含有微量蛋白質(zhì)，不含核酸；紅外光譜分析結(jié)果表明該多糖具有多糖特征吸收，并且含有α、β-糖苷鍵結(jié)構(gòu)；高效離子交換色譜結(jié)果表明青稞麩皮AX的主要單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖，阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物質(zhì)的量比為11.61∶1∶3.62∶18，阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.645。阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值一定程度上反映了多糖結(jié)構(gòu)分支程度，谷物中該比值在0.3～1.1之間，而大麥糊粉層中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在大麥AX提取物中最低，在0.56～0.66之間，反映了大麥糊粉層AX的分支度低[31]。本實(shí)驗(yàn)中青稞麩皮AX主要單糖組成為阿拉伯糖和木糖，分支度較低，與前人對(duì)大麥中AX的研究結(jié)果基本一致。

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