姜夢云，周晏琳，張 晴，劉慧慧，田元勇，劉俊榮*

人類對海洋資源的深度開發(fā)，一方面捕獲了大批未被充分利用的物種（南極磷蝦和鯡魚等），另一方面制造了大量水產品加工的副產物（魚頭、魚骨和魚皮等）。本質上，它們和“魚肉”一樣同屬優(yōu)質蛋白，有關將其中的蛋白質分離回收，轉化成人類食品的研究從未中斷。然而，傳統(tǒng)魚糜對原料要求較高，顯然不具備回收分離此類蛋白質的能力。與傳統(tǒng)魚糜相比，分離魚蛋白在蛋白質分離回收方面具有明顯優(yōu)勢。目前的研究表明，分離魚蛋白具有脫脂、脫臭和脫色等諸多優(yōu)點，完全有潛力成為新型食品蛋白配料。

多數魚蛋白都面臨蛋白質受熱變性，自溶降解的風險，導致其食品功能特性受損，甚至影響人類食用。常見解決方法有在貯藏或加工過程抑制蛋白質變性，如低溫冷藏和水洗處理等；再者是通過技術手段提高蛋白質的功能特性，即蛋白質改性。主流的改性方法有高壓處理，提高六齒金線魚[1]、梅魚[2]等的凝膠性；轉谷氨酰胺酶交聯(lián)，提高竹莢魚[3]、鯉魚[4]及虹鱒[5]等的凝膠性；糖基化，提高鯉魚[6]、鰱魚[7]、黑皮旗魚[8]、蝦夷扇貝[9]和狗鮭[10]等乳化性、熱穩(wěn)定性和溶解性；酶解，提高石首魚[11]、鰹魚[12]、鰻魚[13]、阿根廷魷魚[14]、近江牡蠣[15]的溶解性、乳化性、吸油性和發(fā)泡性。不難看出，蛋白質改性適用于各類水產動物及其副產物，對它們的凝膠性、乳化性、溶解性和發(fā)泡性等重要食品功能特性均有改善作用。可見，蛋白質改性通過修復魚蛋白受損的功能特性，使食用性差的魚蛋白原料能夠被人類接受作為食品蛋白，進而幫助水產蛋白實現資源最大化利用。

本研究以櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和鯉魚（Cyprinus carpio）為研究對象，比較二者分離蛋白的糖基化效果，并對比扇貝分離蛋白糖基化（直接糖基化）和分離蛋白先經酶修飾后糖基化（間接糖基化）的功能改善作用，以探索功能性食品蛋白配料新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

活櫛孔扇貝購于大連新長興水產品市場，殼長（6±0.5）cm。30 min內運輸至實驗室，取閉殼肌，冰中保藏?；铛庺~購于大連沃爾瑪（軟件園）超市，質量（1.5±0.2）kg?，F場速殺，去頭、內臟、魚鱗，15 min內運輸至實驗室，取白色背肌，冰中保藏。

糖化血清蛋白測試盒 南京建成生物工程研究所；MD34透析袋（8 000～14 000 kDa）、胰凝乳蛋白酶、葡萄糖（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑 美國Sigma公司；氯化鈉、硫酸銅（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

BS224S分析天平、BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯有限公司；垂直平板電泳槽 北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司；79-1磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；IMS-25制冰機 常州市雪科電器有限公司；721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離蛋白制備

用堿溶出法制備扇貝、鯉魚的分離蛋白[16]。取剁碎的肉糜與4 倍體積的冷蒸餾水混合，10 000 r/min條件下均質90 s。用2 mol/L氫氧化鈉調pH值至12.0，冰水浴條件下攪拌30 min，10 000×g離心15 min，收集上清液為堿溶蛋白，用3 mol/L鹽酸溶液調pH值至7.0，冷凍干燥后即為扇貝分離魚蛋白（fish protein isolate of scallop，FPIs）和鯉魚分離魚蛋白（fish protein isolate of carp，FPIc）。

1.2.2 胰凝乳蛋白酶修飾

選用胰凝乳蛋白酶對扇貝堿溶蛋白進行酶修飾[17]。將堿溶蛋白用3 mol/L鹽酸溶液調pH值至8.0，30 ℃水浴預熱5min，酶和蛋白質量比為1∶100，30 ℃水浴加熱1 h，1 mmol/L苯甲基磺酰氟滅酶活，冷凍干燥后即為經酶修飾的分離蛋白（H-FPIs）。

1.2.3 糖基化

反應體系內蛋白質量濃度為12 mg/mL，蛋白和葡萄糖質量比為1∶5，糖基化反應溫度為60 ℃，反應相對濕度為65%，反應時間分別為0、2、4 h和6 h。反應結束后，將樣品立即置于冰水浴中冷卻降溫，與15 mL蒸餾水混合，7 000 r/min均質30 s，調pH值至7.0，即為糖基化產物。

1.2.4 指標測定

賴氨酸含量測定：將糖基化產物4 000×g離心15 min，取上清液進行分析。按照Goodno等[18]方法進行測定。160 mg鄰苯二甲醛（o-phthaldehyde，OPA）用4 mL 95%乙醇溶液溶解；2 g十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）用10 mL蒸餾水溶解；38.1 g硼砂用蒸餾水溶解后，用氫氧化鈉調pH 9.5，加水定容至1 L；將2 mL OPA、5 mL SDS、50 mL硼砂及0.2 mL巰基乙醇用水定容至100 mL，即為OPA試劑，當天使用。賴氨酸制作標準曲線。50 μL樣液與2 mL OPA試劑混合，靜置2 min，于波長340 nm處測吸光度。

果糖胺含量[19]測定：將糖基化產物4 000×g離心15 min，將上清液透析24 h后進行分析。按照試劑盒方法測定。50 μL樣液與1 mL試劑混合，37 ℃水浴加熱15 min，室溫條件下冷卻，于波長530 nm處測吸光度。

吸光度測定[20]：將糖基化產物4 000×g離心15 min，取上清液進行分析。0.2 mL樣液與1 mL 0.1% SDS混勻，于波長420 nm處測吸光度。

SDS-PAGE分析：使用SDS-UM蛋白上樣液將糖基化產物稀釋至蛋白質量濃度為1～2 mg/mL，充分溶解后100 ℃加熱5 min。樣品進樣量為10～15 μL。用8%分離膠，6%濃縮膠配制膠板。

乳化性測試[21]：使用蒸餾水將糖基化產物稀釋至蛋白質量濃度為5 mg/mL。2 mL大豆油與8 mL樣品混合，13 500 r/min均質1 min，迅速從底部取50 μL，與5 mL 0.1% SDS混合，于波長500 nm處測吸光度。乳化性按下式計算：

式中：A500nm為吸光度；F為稀釋倍數（100）；C為蛋白質質量濃度（0.005 g/mL）；φ為油相占體積比（0.25）。

熱穩(wěn)定性測定[22]：使用蒸餾水將糖基化產物稀釋至蛋白質量濃度為5 mg/mL。70 ℃水浴加熱15 min，反應結束后，冰水浴冷卻，4 000×g離心15 min，使用雙縮脲法測定上清液中蛋白質質量濃度。

1.3 數據統(tǒng)計分析

所有實驗均進行了3 次重復，數據以平均值表示，用Excel 2010軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 魚貝分離蛋白糖基化特性的分析比較

圖1 鯉魚肌肉與櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白糖基化程度Fig. 1 Characterization of glycosylation of protein isolates from Cyprinus carpio muscle and Chlamys farreri adductor muscle

如圖1所示，鯉魚與扇貝分離蛋白的糖基化程度相同。隨反應的進行，糖基化組（FPIs-G和FPIc-G）的賴氨酸質量濃度減少；果糖胺濃度逐漸積累；肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的電泳條帶遷移率降低且有大分子質量新條帶出現，顯示交聯(lián)聚集發(fā)生；而對照組（FPIs-C和FPIc-C）4 個指標均不發(fā)生改變。其中，反應6 h后，鯉魚（FPIc-G）的賴氨酸質量濃度從356.54 μg/mL減少到143.02 μg/mL，下降59.89%，扇貝（FPIs-G）賴氨酸質量濃度從1 857.56 μg/mL減少到1 282.90 μg/mL，下降30.94%；FPIc-G吸光度在0.000基本保持不變，FPIs-G吸光度0.023增加到0.084；FPIc-G果糖胺濃度從0.28 mmol/L增加到3.04 mmol/L，FPIs-G果糖胺濃度從0.25 mmol/L增加到2.99 mmol/L。由此可見，鯉魚賴氨酸初始質量濃度低于扇貝，但賴氨酸下降率高于扇貝；鯉魚吸光度初始值低于扇貝，且褐變程度小于扇貝；兩者果糖胺濃度和電泳變化情況相似。

分離魚蛋白的糖基化研究鮮見系統(tǒng)報道。目前，多數魚蛋白糖基化的研究是圍繞特異蛋白組分開展的，如Saeki[23]以鯉魚的肌原纖維蛋白為研究對象，整個反應過程無褐變發(fā)生；Maitena等[24]對鯉魚的肌球蛋白進行糖基化后發(fā)現，72 h才發(fā)生顯著褐變；二人均認為其研究中的鯉魚糖基化反應屬于美拉德早期反應，是不會生成引起褐變的類黑素。Wahyuni等[8]利用葡萄糖對黑皮旗魚水溶性蛋白進行糖基化，60 ℃條件下反應6 h，賴氨酸含量減少35%，果糖胺含量顯著增加，僅發(fā)生輕微褐變；Decourcelle等[25]對北極甜蝦酶解物進行木糖接枝后，賴氨酸含量減少30.2%，體系pH值從8.39降至5.72；Nishimura等[26]用褐藻膠寡糖交聯(lián)狗鮭肌原纖維蛋白，60 ℃條件下反應6 h，賴氨酸含量減少41%，結合糖含量為74.8 μg/mg。Katayama等[27]則對比鯉魚和蝦夷扇貝進行了比較研究，針對肌球蛋白尾部組分（胰凝乳蛋白酶消化）糖基化程度時，反應前6 h，鯉魚消耗的賴氨酸含量遠大于扇貝，12 h時兩者持平（鯉魚69%，扇貝73%）。結合上述同類研究可得，各種水產動物，如脊椎動物、雙殼類和甲殼類等均具備良好的糖基化效果，針對的蛋白組分具有特異性，如肌原纖維蛋白、酶解產物、水溶蛋白以及本研究中的分離蛋白等。盡管物種間糖基化程度存在差異，但糖基化程度主要由蛋白源、蛋白組分、處理方式以及糖基化條件決定，即當不同蛋白源使用相同方式進行蛋白質提取和糖基化時，其反應程度相似。

圖2 鯉魚肌肉與櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白糖基化產物功能特性Fig. 2 Functional properties of glycosylated protein isolates from Cyprinus carpio muscle and Chlamys farreri adductor muscle

如圖2所示，糖基化是一種有效分離魚蛋白功能改性方法，且對鯉魚和扇貝的乳化性和熱穩(wěn)定性的改善作用一致。對照組（FPIs-C和FPIc-C）乳化性基本不變，熱穩(wěn)定性大幅下降，而糖基化組（FPIs-G和FPIc-G）乳化性則逐漸增加，同時熱穩(wěn)定性下降明顯趨緩。從糖基化效果來看，FPIc-G在6 h后乳化性從7.39 m2/g增至14.08 m2/g，FPIs-G乳化性從12.35 m2/g增至16.44 m2/g；FPIc-G和FPIc-C的熱穩(wěn)定性分別下降14%和26%，FPIs-G和FPIs-C的熱穩(wěn)定性分別下降28%和50%。Maitena等[24]報道鯉魚肌球蛋白-褐藻膠寡糖產物經過50 ℃、6 h加熱后，熱穩(wěn)定性沒有顯著減少，而對照組（鯉魚肌球蛋白）卻減少了63%；陳欣[28]對羅非魚肌原纖維蛋白-葡聚糖干熱反應進行實驗，乳化活性指數為1.908±0.013，乳化穩(wěn)定性指數為31.545±0.4，熱穩(wěn)定性為（43.53±0.55）%；Liu Yongle等[29]將鰹魚酶解物與褐藻膠進行反應后，乳化性和乳化穩(wěn)定性均顯著提高；Decourcelle等[30]北極甜蝦酶解物糖基化產物乳液的稠度指數從0.54 Pa·sn增加至4.72 Pa·sn，表觀黏度從0.27 Pa·s增至0.81 Pa·s。從上述研究可知，糖基化對功能改善作用適用于各種水產動物及其相關蛋白源類型，能夠賦予魚蛋白優(yōu)良的乳化性和熱穩(wěn)定性。值得注意的是，目前糖基化涉及的功能特性主要集中為乳化性和熱穩(wěn)定性，下一步可以嘗試對發(fā)泡性和凝膠性進行探索。

2.2 胰凝乳蛋白酶修飾對分離蛋白糖基化的影響

如圖3所示，酶修飾對扇貝分離蛋白糖基化反應有促進作用。反應6 h后，對照組（H-FPIs-C和FPIs-C）4 個指標均無明顯變化。直接糖基化組（FPIs-G）的賴氨酸質量濃度從1 857.56 μg/mL減少到1 282.90 μg/mL，下降30.94%，間接糖基化組（H-FPIs-G）賴氨酸質量濃度從2 369.65 μg/mL減少到766.86 μg/mL，下降67.64%；FPIs-G吸光度從0.023增至0.084，增長265%，H-FPIs-G吸光度從0.015增至0.087，增長500%；FPIs-G果糖胺濃度從0.25 mmol/L增加到2.99 mmol/L，H-FPIs-G果糖胺濃度從0.50 mmol/L增加到5.72 mmol/L；H-FPIs-G的電泳各條帶遷移率減少幅度大于直接糖基化，表明，且交聯(lián)聚集的速率更快。推測原因是，分離蛋白經酶修飾后，首先蛋白質鏈變短，并且還暴露出更多的氨基，都更有利于與糖結合；另外蛋白質結構的變化，導致空間位阻改變，也幫助蛋白與糖結合。目前關于分離魚蛋白糖基化（直接糖基化）和分離蛋白先經酶修飾后糖基化（間接糖基化）的比較缺乏系統(tǒng)報道，本研究作為初步探索性嘗試，得出酶修飾對分離魚蛋白糖基化反應有促進作用，可以為之后相關研究提供參考。

圖3 櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白與酶修飾物糖基化程度Fig. 3 Characterization of glycosylation of protein isolate and hydrolysate from Chlamys farreri adductor muscle

圖4 櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白與酶修飾物糖基化產物功能特性Fig. 4 Functional properties of glycosylated protein isolate and hydrolysate from Chlamys farreri adductor muscle

如圖4所示，酶修飾可以提高分離蛋白糖基化的功能改善作用，分離魚蛋白可以通過復合改性（酶修飾加糖基化）獲得更好的功能特性。其中反應6 h后，直接糖基化組（FPIs-G）的乳化性提高33.11%，間接糖基化組（H-FPIs-G）的乳化性提高37.38%；兩者熱穩(wěn)定性分別下降28%和3%。水產蛋白中圍繞酶修飾和糖基化復合改性對比的研究鮮見系統(tǒng)報道，但已有大量研究證實酶修飾是水產蛋白有效的功能改性方式，如石首魚[11]、鰹魚[12]、鰻魚[13]等，另外也有許多關于酶修飾物的糖基化研究，如王軍等[31]的金帶細鲹胰蛋白酶修飾物葡萄糖糖基化研究、Decourcelle等[30]的北極甜蝦酶解物研究及Liu Yongle等[29]的鰹魚酶解物研究等，且均表明糖基化可以改善酶修飾物的功能特性，將這兩類研究報道結合起來可得，酶修飾和糖基化復合改性可以改善水產蛋白功能性，此推論與本研究結論一致。而該復合改性針對大豆蛋白的研究較系統(tǒng)：Zhang Yating等[32]比較了大豆分離蛋白、大豆分離蛋白酶解物和大豆分離蛋白酶解物糖基化產物的功能特性，發(fā)現大豆分離蛋白的乳化性為86.137 8 m2/g，大豆分離蛋白酶解物的乳化性為91.577 8 m2/g，大豆分離蛋白酶解物-麥芽糊精糖基化產物的乳化性為109.077 8 m2/g；三者熱變性溫度依次為96.99、98.32 ℃和100.78 ℃；另有張晉博[33]在對大豆7S蛋白先進行先糖基化修飾，后對其產物進行胰蛋白酶酶解，得到大豆7S、大豆7S-葡聚糖糖基化產物和大豆7S-葡聚糖糖基化產物水解物的油-水界面的πsat分別為（13.8±0.5）、（17.3±0.6）mN/m和（19.2±0.5）mN/m，且大豆7S-葡聚糖糖基化產物水解物具有最高的乳液液滴表面吸附量。由此可見，無論是已商業(yè)化的大豆蛋白，亦或是尚處在研究階段的水產蛋白，蛋白質經過酶修飾和糖基化復合改性可以大大提高其功能特性。

3 結 論

本研究以分離魚蛋白為出發(fā)點進行了糖基化功能改性嘗試，在分離魚蛋白的糖基化特性，無脊椎貝類和脊椎魚類不同蛋白源之間的差異，以及胰凝乳蛋白酶修飾對分離蛋白糖基化的促進效果等方面獲得有價值的發(fā)現。對分離魚蛋白的糖基化功能改性的基本規(guī)律有了初步了解?？傮w研究結論為分離魚蛋白可以有效進行糖基化且功能有所改善；魚類與貝類的分離蛋白糖基化特性基本沒有差異；分離魚蛋白可以通過復合改性，即胰凝乳蛋白酶修飾后再糖基化，可以獲得更好的功能特性。

本研究僅選擇胰凝乳蛋白酶作為工具酶，今后可以考慮結合不同蛋白酶，探討由蛋白特異性水解所帶來的具有不同功能性蛋白改性產物的可能性。此外，未來可繼續(xù)深入水產蛋白的復合改性研究，嘗試結合如羥甲基化等其他改性手段對蛋白質進行疊加修飾。

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