童軍衛(wèi)，劉補興，胡小銘，李 燁，劉正敏，蔡清風*

0 引言

膠質瘤(Glioma)是源自神經上皮的惡性腫瘤，是顱內發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病機制尚不清楚[1]。目前，手術、放療、化療是惡性腫瘤治療的主要手段，然而膠質瘤生長迅速，呈浸潤性生長，手術治療難以切除癌變組織，而且放療和化療藥物毒副作用大，容易產生耐藥性。因此，采用安全有效的藥物治療膠質瘤已經成為研究的熱點問題。近年來，植物來源的藥物已經廣泛應用于腫瘤的治療中?？囫R豆素(Swainsonine，SW)是澳洲學者Colegate從灰苦馬豆(Swainsonacanescens)分離得到的主要提取成分，苦馬豆素作為抗癌天然小分子藥物，被廣泛應用于食道癌、胃癌和肝癌的基礎研究中[2-4]。研究表明，苦馬豆素能夠抑制腫瘤細胞生長轉移、誘導細胞凋亡，同時還能提高機體免疫力，增強對腫瘤細胞的抵抗能力[5]。然而苦馬豆素對膠質瘤細胞U87凋亡及其相關作用機制方面的研究尚未見報道。本研究旨在利用人膠質瘤細胞系U87，闡明苦馬豆素對膠質瘤細胞U87凋亡及HSP90/AKT通路的影響，以探究苦馬豆素抗腫瘤作用的潛在分子機制，為膠質瘤靶向藥物的開發(fā)及臨床治療提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人口膠質瘤細胞U87由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 苦馬豆素購自陜西楊陵大正生物技術有限公司。RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶購自NEB公司；鼠抗人caspase 3多克隆抗體、鼠抗人HSP90多克隆抗體和鼠抗人AKT多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；BD-FAC Scan流式細胞儀購自美國BD公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺購自蘇州蘇凈；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將購買的U87細胞解凍復蘇，按1×106/mL接種于DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基中[10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素]，置于37 ℃ 5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。全量更換DMEM培養(yǎng)基，調整細胞數目為1×106/mL接種于24孔細胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，分別加入苦馬豆素使無血清培養(yǎng)基中苦馬豆素的含量分別為0、4、8、12 μg/mL，依次命名為對照組、苦馬豆素低劑量組、苦馬豆素中劑量組、苦馬豆素高劑量組，每組重復6孔。培養(yǎng)48 h。

1.2.2 U87細胞形態(tài)變化比較 培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，將各組細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2～3次后，加入0.125%胰蛋白酶消化2～3 min，加入75%乙醇固定細胞，置于4 ℃下過夜，次日棄去乙醇后，用PBS漂洗細胞2～3次。加入0.5 mL膠質纖維酸性蛋白，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 培養(yǎng)結束后，用PBS洗滌細胞2～3次后，用胰蛋白酶消化細胞2～3 min，加入75%乙醇于4 ℃下過夜固定細胞，用PBS漂洗細胞，置于超低溫離心機2 000 r/min離心10 min，棄去上清，此過程重復2～3次；加入10 μL RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μL PI進行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。使用BD-FAC Scan流式細胞儀進行數據采集和分析。使用ModFit LT軟件進行凋亡細胞百分比計算。

1.2.4 qRT-PCR檢測caspase 3、HSP90、AKT基因表達情況 離心收集各組U87細胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉呈cDNA。然后根據NCBI上提交caspase 3、HSP90、AKT的cDNA序列設計引物。caspase 3：上游引物F：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTC-3′，下游引物R：5′-CTCAGAAGCACACAAACAAAA-3′；HSP90：上游引物F：5′-GGAATTGGAATGACCAAGGC-3′，下游引物R：5′-AGCAGAATGTGACTCGAGCA-3′；AKT：上游引物F：5′-CGGCAGGACCGAGC-3′，下游引物R：5′-TTGAAGAATTTGGAGGGAAGG-3′，進行qRT-PCR，同時以GAPDH為內參。PCR的反應體系為：5X緩沖液10 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，上游引物F 2 μL，下游引物R 2 μL，10 mmol dNTP mix 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL；PCR的反應條件為：預變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：63 ℃ 15 s(caspase 3、HSP90、AKT和GAPDH)，40個循環(huán)，延伸時讀取光密度(D)值。采用最大二階導數法(2-△△Ct)對數據進行統(tǒng)計?！鳌鰿t=(實驗組目的基因Ct平均值-實驗組內參基因Ct平均值)-(對照組目的基因Ct平均值-對照組內參基因Ct平均值)。

1.2.5 Western blot檢測caspase 3、HSP90、AKT蛋白表達情況 培養(yǎng)48 h后收集細胞，按每1×106個細胞加入0.5 mL細胞裂解液[150 mmoL/L NaCl，1.0% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris(pH 8.0)]提取細胞總蛋白，以GAPDH為內參，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣體積20 μL，電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，分別滴加鼠抗人caspase 3、HSP90、AKT多克隆抗體，置于4 ℃下過夜，滴加二抗，37 ℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結果

2.1 U87細胞形態(tài)變化比較 培養(yǎng)48 h后，對照組U87細胞形態(tài)多樣，大小不一，胞體上有突起，向周圍延伸，且染色質均勻分布，結果見圖1a；苦馬豆素組細胞的數量明顯減少，細胞稀疏生長，細胞和細胞核體積明顯縮小，細胞質濃縮，細胞內染色質固縮，有的細胞出現凋亡小體；且隨著苦馬豆素劑量的增加，U87細胞形態(tài)變化越明顯，結果見圖1b～圖1d。

圖1 苦馬豆素對U87細胞形態(tài)的影響

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 膠質瘤細胞U87經不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，U87細胞的凋亡率增加，呈現劑量依賴性，結果見圖2。

圖2 苦馬豆素對U87細胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P<0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

2.3 qRT-PCR檢測caspase 3、HSP90、AKT基因表達情況 膠質瘤細胞U87經不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組caspase 3 mRNA的表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3 mRNA的表達水平顯著提高，呈現劑量依賴性，結果見圖3。

膠質瘤細胞U87經不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組HSP90 mRNA、AKT mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，HSP90 mRNA、AKT mRNA的表達水平顯著降低，呈現劑量依賴性，結果見圖4。

圖3 qRT-PCR檢測caspase 3基因表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

圖4 qRT-PCR檢測HSP90、AKT基因表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

2.4 Western blot檢測caspase 3、HSP90、AKT蛋白表達情況 膠質瘤細胞U87經不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組caspase 3蛋白的表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3蛋白的表達水平顯著提高，呈現劑量依賴性，結果見圖5。

圖5 Western blot檢測caspase 3蛋白表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

膠質瘤細胞U87經不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組HSP90、AKT蛋白的表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，HSP90、AKT蛋白的表達水平顯著降低，呈現劑量依賴性，結果見圖6。

圖6 Western blot檢測HSP90、AKT蛋白表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

3 討論

苦馬豆素是從植物中提取的一種吲哚里西啶生物堿，具有突出的抗腫瘤作用。研究表明，苦馬豆素通過抑制腫瘤細胞表面糖蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，誘導癌細胞凋亡[6-7]。Dennis[8]研究表明，苦馬豆素能夠抑制結腸腫瘤的生長。Seftor等[9]研究表明，苦馬豆素可以抑制腫瘤細胞Ⅳ型膠原酶的表達，阻止腫瘤細胞浸潤、轉移。吳達等[10]研究表明，低濃度的苦馬豆素就可以誘導腫瘤細胞相關基因上調或下調表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡，苦馬豆素還可以通過誘導內質網凋亡途經實現人胃癌細胞SGC-7901、人食道癌Eca-109細胞、肝癌細胞等的凋亡[11]。You等[12]研究表明，苦馬豆素能促進肝癌細胞HepG2凋亡，de-Freitas-Junior等[13]研究表明，苦馬豆素能促進結腸癌HTC-116細胞凋亡。以上結果證實，苦馬豆素能抑制腫瘤細胞的生長和轉移、誘導癌細胞凋亡。本研究表明，苦馬豆素會引起膠質瘤細胞U87形態(tài)的變化，誘導細胞凋亡，且隨著苦馬豆素劑量的增加，U87細胞的凋亡率顯著增加，與上述研究結果一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族與細胞凋亡密切相關，細胞凋亡的關鍵是caspase被激活，當caspase的活性受到抑制時，就會引起腫瘤的發(fā)生[14-15]。caspase家族有16個成員，caspase 3是凋亡的主要參與成分。caspase 3能特異性切割DNA，使染色質凝聚、核酸酶激活，進而導致細胞凋亡。鄭愛秋等[16]研究表明，caspase 3在癌組織中通過促進癌細胞凋亡而使惡性程度降低；Hay等[17-18]研究表明，重組蛋白IAP可以下調caspase 3或caspase 7的表達，阻止細胞凋亡；然而苦馬豆素對膠質瘤細胞U87中caspase 3表達水平的影響尚未見報道。本研究表明，膠質瘤細胞U87經苦馬豆素處理后，caspase 3表達水平升高，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3表達水平顯著提高，呈劑量依賴性，進一步證實苦馬豆素能夠誘導膠質瘤細胞U87的凋亡。

熱休克蛋白(Heat shock protein 90，HSP90)作為一種分子伴侶能夠參與各種信號轉導通路，如細胞生長、周期調控和細胞存活等，并與通路中的關鍵分子相互作用，通過與底物蛋白活性部位的結合，使其維持正常的功能[19]。近年研究表明，運用HSP90抑制劑，可以提高細胞的凋亡率，提示HSP90能夠促進細胞存活、抑制細胞凋亡[20]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Serine threonine kinase，AKT)是原癌基因v-Akt的同源物，參與caspase 3的活化[21]。AKT能夠參與許多細胞的信號轉導通路，如：PI3K/AKT、DNA-PKcs/Akt、Epac/Akt等，這些信號通路與細胞的生長、細胞周期以及調控細胞凋亡等密切相關，且AKT是信號轉導通路中的關鍵蛋白。AKT是HSP90的底物蛋白，研究表明,HSP90能夠與AKT結合，阻止AKT的去磷酸化，保護AKT的活性功能不喪失[22]。Shaknovich等[23]研究表明,AKT的活化需要AKT與HSP90及伴侶分子Cdc37組成復合物，HSP90的伴侶功能對于維持該復合體的存在至關重要。Li等[24]研究表明，HSP90/Akt信號通路能夠誘導膿毒癥小鼠心肌細胞中caspase 3的活化，進而誘導心肌細胞的凋亡；Gong等[25]研究表明，海兔素通過抑制HSP90/Akt信號通路中相關蛋白(HSP90和Akt)的表達水平，進而誘導膠質瘤細胞GL26凋亡；Maria等[26]研究表明，用HSP90和Akt抑制劑靶向抑制信號通路PI3K/Akt/HSP90，可以促進人胃癌細胞凋亡。以上研究均提示，HSP90/Akt信號通路與細胞凋亡密切相關。雖然國內外對HSP90、AKT及HSP90/AKT信號通路方面均進行了初步研究,但是苦馬豆素對于膠質瘤細胞HSP90/AKT信號通路的影響尚未見報道。本研究表明,苦馬豆素能夠抑制HSP90/AKT信號通路中HSP90和AKT蛋白的表達，促進膠質瘤細胞的凋亡，且隨著苦馬豆素劑量增加，膠質瘤細胞U87凋亡水平顯著升高，呈劑量依賴性，推測苦馬豆素促進膠質瘤細胞U87凋亡的機制是通過抑制HSP90/AKT信號通路的活性來實現的。

綜上所述，苦馬豆素能夠抑制HSP90/AKT信號通路中HSP90和AKT蛋白的表達，促進膠質瘤細胞U87凋亡，為膠質瘤的臨床治療和膠質瘤靶向藥物的開發(fā)提供一定的理論基礎。

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