羅云 王瑜敏 羅盛

隨著免疫抑制劑、激素、廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用，以及器官移植技術(shù)的開展、各種導(dǎo)管的應(yīng)用及腫瘤化療等，使各種條件致病菌尤其是真菌感染日趨嚴(yán)重［1-2］。當(dāng)前臨床感染的真菌雖以白色假絲酵母菌感染為主，但非白色假絲酵母菌感染比率逐年上升。有研究報(bào)道稱，熱帶假絲酵母菌是導(dǎo)致假絲酵母菌感染的第二常見原因［3］。為探討熱帶假絲酵母菌的臨床感染及其對(duì)抗真菌藥物的耐藥狀況，為預(yù)防與控制醫(yī)院真菌感染提供依據(jù)，本資料對(duì)本院2013年7月至2016年7月收治的47例熱帶假絲酵母菌進(jìn)行了回顧性的臨床調(diào)查，并對(duì)分離菌株進(jìn)行了生化特性和對(duì)抗真菌藥物的敏感情況分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年7月至2016年7月收治的血培養(yǎng)“熱帶假絲酵母菌”陽性病例共47例。其中男31例，女16例，年齡中位數(shù)51歲；＜20歲患者5例，21～40歲4例，41～60歲29例，≥61歲9例；血液內(nèi)科24例，重癥監(jiān)護(hù)12例，急診、呼吸、消化和胃腸外科等總共11例。

1.2 方法 （1）菌株和培養(yǎng)：對(duì)患者的血培養(yǎng)分離真菌采用VITEK2全自動(dòng)鑒定儀及配套酵母樣真菌鑒定卡YST作假絲酵母菌屬菌種鑒定，確定其為“熱帶假絲酵母菌”菌屬。分離菌株保存于瓊脂糖平板（含1%蛋白胨和2%葡萄糖，YCB agar，Difco Laboratories，USA），在含1%蛋白胨和2%葡萄糖的YCB液體培養(yǎng)基（YCB，Difco Laboratories）中37℃預(yù)培養(yǎng)24h，離心收集菌體，用PBS洗兩次，調(diào)整菌體數(shù)用于生化特性鑒定。（2）真菌生化特性的鑒定：生化特性鑒定包括蛋白酶、脂肪酶和葡糖苷酶活性鑒定。蛋白酶活性鑒定：取預(yù)培養(yǎng)的真菌，在含5% 牛血清蛋白（BSA；Sigma Chemical Co.，USA）的YCB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d，取0.2ml上清液與1ml含5% BSA的乙酸鈉（1M，pH4.0）溶液在37℃共培養(yǎng)1h，之后加入1.0 ml 三氯乙酸（10%，TCA； Sigma）終止反應(yīng)。離心后取上清液檢測(cè)750nm吸光度值；脂肪酶活性鑒定：取預(yù)培養(yǎng)的真菌，在含2.5% Tween-80的YNB培養(yǎng)基（0.7%YNB，Difco Laboratories）中37℃培養(yǎng)3d，之后用lipase assay kit（Toyobo，Osaka，Japan）檢測(cè)其脂肪酶活性；葡糖苷酶活性鑒定：取預(yù)培養(yǎng)的真菌，在含0.6% 麥芽糖的YNB培養(yǎng)基（0.7%YNB，Difco Laboratories）中37℃培養(yǎng)16h，取上清液，與含5mM吡喃葡糖苷的檸檬酸鹽溶液（pH6.0）在37℃反應(yīng)30min，0.1M的Na2CO3終止反應(yīng)，測(cè)其在405nm的吸光度值。所有試驗(yàn)中均采取實(shí)驗(yàn)室保存分離的白色假絲酵母菌作為對(duì)照。（3）體外抗真菌藥物敏感性檢測(cè)：采用ATBTM FUNGUS3真菌藥敏卡進(jìn)行常用抗真菌藥物體外敏感性檢測(cè)，包括5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。（4）治療情況和預(yù)后分析：采用卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯(lián)合兩性霉素B治療后患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況，死亡比例及死亡原因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采取SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株生化特性鑒定 對(duì)分離的真菌培養(yǎng)物全部進(jìn)行生化特性鑒定，包括蛋白酶活性，脂肪酶活性和葡糖苷酶活性。每株真菌培養(yǎng)物進(jìn)行3次平行試驗(yàn)測(cè)試，取平均值進(jìn)行記錄分析。本資料分離的熱帶亞熱帶假絲酵母菌的蛋白酶活性顯著低于白色假絲母菌（P＜0.05），葡糖苷酶活性顯著高于白色假絲酵母菌（P＜0.05），脂肪酶活性無顯著差異。

2.2 菌株耐藥性分析 分離的47株真菌，均對(duì)5-氟胞嘧啶和兩性霉素B敏感，對(duì)氟康唑敏感為63.8%（30/47），對(duì)伊曲康唑敏感為59.6%（28/47），對(duì)伏立康唑敏感為68.1%（32/47），見表1。最小抑菌濃度（MIC）：5-氟胞嘧啶完全敏感濃度≤2μg/ml；氟康唑完全敏感濃度≤8μg/ml，劑量依賴性敏感濃度16～32μg/ml，抵抗?jié)舛?＞32μg/ml；伏立康唑完全敏感濃度≤1μg/ml，劑量依賴性敏感濃度2～4μg/ml，抵抗?jié)舛龋?μg/ml；伊曲康唑完全敏感濃度≤0.125μg/ml，劑量依賴性敏感濃度0.25～0.5μg/ml，抵抗?jié)舛龋?.5μg/ml。兩性霉素B完全敏感濃度≤ 1μg/ml。

表1 菌株耐藥性分析

2.3 治療方法與預(yù)后分析 對(duì)患者采取卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯(lián)合兩性霉素B針抗真菌治療，治療結(jié)果表明，23例患者預(yù)后良好（49.0%），24例患者死亡（51.0%），主要死亡原因?yàn)楦腥拘孕菘撕投嗯K器功能衰竭，見表2。

表2 治療方案與預(yù)后分析（n）

3 討論

熱帶假絲酵母菌是一種腐物寄生菌，廣泛分布于自然界，也可存在于健康人體的體表皮膚和外界相通的腔道中，如口腔、消化道、陰道等部位。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或局部環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，熱帶假絲酵母菌易致病是一種條件致病菌，而且，熱帶假絲酵母菌感染的發(fā)生率和病死率要高于白色假絲酵母菌。熱帶假絲酵母菌常引起免疫功能減弱患者肺部感染、血液感染、泌尿系統(tǒng)感染、生殖系統(tǒng)感染、眼部感染乃至全身感染。目前國內(nèi)外對(duì)熱帶假絲酵母菌引起的感染以研究血液感染居多［4］。

熱帶假絲酵母菌呈圓形或卵圓形，直徑3～6μm，革蘭氏染色陽性，著色不均勻。沙氏瓊脂上呈奶油樣，灰白色，柔軟，菌落光滑，邊緣或有皺褶，而在吐溫80玉米粉瓊脂平板上可見大量菌絲，上附芽生孢子，不產(chǎn)生厚膜孢子。在血清中不產(chǎn)生典型的芽管； 少數(shù)菌株圓形孢子出芽處明顯狹窄，“芽管”較粗。能同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、木糖、海藻糖，尚同化纖維二糖，不同化L-阿拉伯糖和鼠李糖。該菌除可在黏膜細(xì)胞上增殖引起感染外，其產(chǎn)生的毒素可引起過敏反應(yīng)及產(chǎn)生水解酶類，引起組織損傷，重者可導(dǎo)致患者死亡［5］。

本資料中患者多分布于血液內(nèi)科，ICU次之，其余來源于急診、呼吸、消化和胃腸外科等。這些患者的共同特點(diǎn)是：長期患病，病情較重，年老體弱，免疫力極度低下，定期放化療，長期應(yīng)用免疫抑制劑，皮質(zhì)激素，長期反復(fù)使用多種廣譜抗菌藥物，破壞了機(jī)體自然保護(hù)屏障，導(dǎo)致體內(nèi)微生態(tài)平衡紊亂，造成菌群失調(diào)，抑制了常見的條件致病菌，使假絲酵母菌屬大量繁殖。此外，臨床創(chuàng)傷性診療手段的廣泛開展，如氣管插管、氣管切開、各種插管的留置等因素降低了機(jī)體正常防御功能，為假絲酵母菌屬的侵入提供了條件。

熱帶假絲酵母菌的生化反應(yīng)顯示，本資料中分離的熱帶假絲酵母菌的蛋白酶活性顯著低于白色假絲酵母菌（P＜0.05），葡糖苷酶活性顯著高于白色假絲酵母菌（P＜0.05），脂肪酶活性無顯著差異。體外藥物敏感試驗(yàn)提示，分離的47株真菌，均對(duì)5-氟胞嘧啶和兩性霉素B敏感，說明5-氟胞嘧啶和兩性霉素B是治療深部真菌的首選藥物，5-氟胞嘧啶不良反應(yīng)輕，而兩性霉素B不良反應(yīng)較大，但5-氟胞嘧啶較少單獨(dú)用藥，一般與兩性霉素B 聯(lián)合應(yīng)用；對(duì)氟康唑的敏感率為63.8%（30/47），對(duì)伊曲康唑的敏感率為59.6%（28/47），對(duì)伏立康唑的敏感率為68.1%（32/48），氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑是三唑類藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用，其作用于細(xì)胞色素P450 酶和14α-脫甲基酶，最終使麥角醇合成受阻，造成甲基戊酸在細(xì)胞內(nèi)的堆集，使膜結(jié)構(gòu)破壞，抑制真菌生長，這是三唑類藥物的共同作用機(jī)制，亦是造成交叉耐藥的理論基礎(chǔ)。隨著越來越多的抗真菌藥物被應(yīng)用于臨床，深部真菌的耐藥性也在明顯增加，尤其是對(duì)作為一線藥物的氟康唑。目前，就氟康唑的使用是否是導(dǎo)致非白假絲酵母菌感染比例上升的原因仍存在爭議。實(shí)際上臨床治療真菌感染并不容易，因?yàn)槊糠N抗真菌藥物都有一定的毒性作用，而其毒性作用限制了用量和使用方式，使感染部位藥物濃度偏低，而達(dá)不到殺菌程度。作者在臨床上采取對(duì)患者進(jìn)行卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯(lián)合兩性霉素B針抗真菌治療，治療結(jié)果表明，23例患者預(yù)后良好（49.0%），24例患者死亡（51%），造成死亡的主要原因?yàn)楦腥拘孕菘撕投嗯K器功能衰竭。

有關(guān)體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效的一致性尚需進(jìn)一步研究。熱帶假絲酵母菌作為重要的非白假絲酵母菌，感染日益增多，且會(huì)導(dǎo)致比其它假絲酵母菌更高的病死率，因此臨床需要尤其重視其感染情況，機(jī)體的抵抗力與免疫力低下與真菌感染有重要關(guān)系，因此對(duì)于年齡大、免疫力低下、住院時(shí)間長、長期使用抗生素等危險(xiǎn)因素的患者，臨床醫(yī)生需尤其注意真菌的感染。微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此類菌株的檢測(cè)，并將酵母菌屬鑒定至種的水平。同時(shí)為預(yù)防與控制耐藥菌株的進(jìn)一步增加，給臨床治療提供依據(jù)，及時(shí)準(zhǔn)確地了解和掌握醫(yī)院真菌感染和耐藥情況至關(guān)重要。

［1］ Laupland KB, Gregson DB, Church DL, et al． Invasive Candida species infections: a 5 year population-based assessment． Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 56(3): 532-537．

［2］ Wang JL, Chang SC, Hsueh PR, et al． Species distribution and fluconazole susceptibility of Candida clinical isolates in a medical center in 2002． Journal of microbiology, immunology, and infection, 2004, 37(4): 236-241．

［3］ 李文革, 程穎, 吳媛, 等． 王靖醫(yī)院內(nèi)假絲酵母菌感染的菌種構(gòu)成和耐藥性分析． 疾病監(jiān)測(cè), 2013, 28(8): 684-687．

［4］ Chiu YS, Chang SC, Hsueh PR, et al． Survey of amphotericin B susceptibility of Candida clinical isolates determined by E-test．Journal of microbiology, immunology, and infection, 2006, 39(4):335-341．

［5］ Mandelblat M, Frenkel M, Abbey D, et al． Phenotypic and genotypic characteristics of Candida albicans isolates from bloodstream and mucosal infections． Mycoses, 2017, 60(8): 534-535．