劉佳 閆昭芫 鄭思彤 甘力 柴惠★

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）致心血管疾病占當(dāng)代城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，嚴(yán)重威脅人類的生活質(zhì)量，縮短預(yù)期壽命［1］。近年來(lái)，隨著納米顆粒生物學(xué)效應(yīng)和安全性研究的不斷深入，納米顆粒與藥物結(jié)合用于疾病的治療被認(rèn)為是可行的［2］，心血管系統(tǒng)也逐漸被認(rèn)為是納米材料與藥物接合作用有效應(yīng)靶點(diǎn)之一［3］。姜黃素是從姜科植物根莖中提取的酚性物質(zhì)，目前研究表明姜黃素在體外良好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用。是一種已證實(shí)具有療效的傳統(tǒng)中藥［4］。但因姜黃素極性小難溶于水、生物半衰期短、穩(wěn)定性差、代謝消除速率快的特點(diǎn)，導(dǎo)致在臨床上應(yīng)用受到限制［5］。本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體作為納米材料包被姜黃素。脂質(zhì)體的體內(nèi)代謝產(chǎn)物為大豆卵磷脂，在臨床上已證實(shí)其大劑量安全性［6］。本研究旨在觀察姜黃素納米新劑型對(duì)ICAM-1的表達(dá)以及NO生成有無(wú)影響，進(jìn)一步豐富其在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的藥理使用方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 HUVEC細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS溶液、胰酶-EDTA（均購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；TNF-α、大豆卵磷脂、膽固醇（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）；MTT 染料（上海拜力生物科技有限公司）；NO試劑盒、ICAM-1 ELISA試劑盒（均購(gòu)自南京建成生物工程研究所）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Ferments公司）、PCR marker（日本Takara公司）。PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司，CFX96Touch）； 680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥劑制備 采用薄膜-超聲法制備。精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇，以一定的比例混勻加入具塞三角瓶中，加入15ml氯仿使其溶解，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氯仿蒸發(fā)，可逐漸觀察到瓶壁內(nèi)形成的一層均勻脂膜。繼續(xù)干燥，待氯仿全部揮發(fā)，加入15ml乙醚溶解脂膜。隨后加入含姜黃素的乙醇溶液5ml，于恒溫振蕩器內(nèi)充分振蕩混合，借助超聲儀上超聲成油包水型乳劑。靜置30min后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，可觀察到瓶壁上形成的凝膠，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使凝膠脫落。最后，加入pH6.8的PBS溶液50 ml使凝膠溶脹，即得到脂質(zhì)體的混懸液。一切操作之前所有器材均照射紫外光30min，結(jié)束操作后姜黃素脂質(zhì)納米粒經(jīng)0.45μm濾菌器過(guò)濾，4℃冰箱保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 設(shè)定培養(yǎng)箱溫度恒溫37℃、5% CO2和95%空氣飽和濕度。將第6代HUVEC穩(wěn)定細(xì)胞株接種至6孔板，添加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)75%～85%時(shí)，換成含0.5% FBS的DMEM饑餓培養(yǎng)8h后加藥處理。細(xì)胞分成6 組：空白對(duì)照組（正常生長(zhǎng)，不用任何藥物處理）、TNF-α模型組（加入10μg/L TNF-α培養(yǎng)6h）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體空藥物組（用不含藥物的納米空顆粒30μg/ml預(yù)處理1h后，再直接與1μg/L TNF-α反應(yīng)6h）、TNF-α+不同濃度姜黃素納米顆粒藥物組3組（5mg/L、15mg/L、30mg/L，分別預(yù)處理1h后再加入10μg/L TNF-α共培養(yǎng) 6h）。

1.4 MTT法檢測(cè)姜黃素脂質(zhì)納米粒對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，反復(fù)吹打后將細(xì)胞接種于96孔板，每孔容積200μl，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步于G0/G1 期，作用時(shí)間分別為6h，12h，24h，每孔加入5mg/L MTT溶液20μl，4h后吸棄上清液，每孔加入DMSO 200μl溶解結(jié)晶物，振蕩10min。在酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定各孔的吸光值（OD 值）。并按照以下公式計(jì)算各組細(xì)胞生存率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Trazol法提取各組細(xì)胞RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用實(shí)時(shí)定量PCR儀器檢測(cè)基因表達(dá)量。使用96孔板，每組設(shè)立至少三個(gè)平行重復(fù)樣。每孔為20μl反應(yīng)體系， 包 含 ：SYBR Fast qPCR Mix（2X），10μl；PCR Forward Primer（10μm），0.8μl；PCR Reverse Primer（10μM），0.8μl；DNA 模 板，2μl；ddH2O，6.4μl。反應(yīng)條件：95℃，5min；95℃，20s；55℃，30s；72℃，10min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)10min。每個(gè)樣品按相同條件重復(fù)3次，與內(nèi)參GAPDH均一化消除實(shí)驗(yàn)誤差后取平均值。引物由上海生工生物工程公司合成，如下表：

eNOS 引物序列

1.6 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中ICAM-1的蛋白水平 各組按不同藥物處理后，細(xì)胞用無(wú)菌預(yù)冷PBS漂洗3次，分別加入100μl 80%乙醇，使乙醇均勻分布在每孔孵育10min以固定細(xì)胞；再經(jīng)PBS洗滌后，3% BSA室溫封閉1h；加入ICAM-1抗體50μl（稀釋倍數(shù)：1：500），于37℃室溫孵育 1h；TBST洗滌10min 重復(fù)3次，孵育二抗。加入顯色劑100μl，37℃避光15min，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于490nm處讀取吸光值。

1.7 檢測(cè)血清NO含量 吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用偶氮化合物硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO含量。NO在氧氣和水存在條件下生成硝酸鹽與亞硝酸鹽，后二者在硝酸鹽顯色劑作用呈淡紅色，通過(guò)比色法得到NO含量。（參照南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒使用說(shuō)明書(shū)）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥劑制備 與純水比較姜黃素脂質(zhì)納米粒劑型澄清透明，無(wú)任何沉淀。透射電子顯微鏡下納米結(jié)構(gòu)粒徑約為150～200nm。制劑成功。

2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素脂質(zhì)納米粒對(duì)細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)表1。

表1 不同濃度藥物處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同藥物處理組對(duì)HUVEC細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，模型組TNF-α顯著促進(jìn)ICAM-1表達(dá)（P＜0.01），而姜黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可顯著抑制由其誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)量增加（P＜0.01）。

2.4 eNOS的基因表達(dá) 結(jié)果顯示，比較較于空白對(duì)照組，模型組TNF-α顯著降低eNOS表達(dá)（P＜0.01），而姜黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可顯著升高由其誘導(dǎo)的eNOS 表達(dá)量增加（P＜0.01）。

2.5 Elisa 不同濃度姜黃素脂質(zhì)納米粒對(duì)HUVEC細(xì)胞ICAM-1分泌的影響 見(jiàn)表2。

表2 不同藥物處理組對(duì)HUVEC細(xì)的ICAM-1表達(dá)量

2.6 NO表達(dá)量 與空白對(duì)照組比較，模型組在TNF-α作用下，NO表達(dá)量明顯下降（P＜0.01）。而姜黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可促進(jìn)細(xì)胞分泌的NO的增加（P＜0.01）。

3 討論

納米材料是三維空間尺寸至少有一維處于納米量級(jí)（1～100nm）的材料。這些合成的顆粒（一般是來(lái)自于聚合物，脂質(zhì)或金屬），這些小顆粒物能夠與治療藥物偶聯(lián)在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸，從而運(yùn)送至指定部位并得到富集［7］。其可降解的外殼可以幫助藥物在到達(dá)指定部位后緩釋［8］。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為致密的組織屏障，其本身生理學(xué)作用決定其對(duì)外界物質(zhì)吸收率低。納米載體使得藥物靶向并有助于隨后的滲透進(jìn)入或穿過(guò)內(nèi)皮，提供由它們的非靶向?qū)?yīng)物無(wú)法實(shí)現(xiàn)的治療效果。姜黃素脂質(zhì)體納米顆粒的優(yōu)勢(shì)在于改變難溶藥物因極性原因難以到達(dá)病灶發(fā)揮藥效的缺點(diǎn)。

一氧化氮合酶（eNOS）功能障礙與AS發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系，起到根本性作用。隨著動(dòng)脈粥樣硬化病情逐漸發(fā)展，內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的具有血管松弛作用和抗AS的主要分子NO合成和釋放減少，內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子與流經(jīng)血液中的各型白細(xì)胞結(jié)合，釋放水解酶、細(xì)胞因子等促使炎癥細(xì)胞進(jìn)入血管上皮層內(nèi)，引發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生、斑塊進(jìn)一步生長(zhǎng)，加重病情。NO能夠起到血管擴(kuò)張作用，調(diào)控血小板聚集、單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及血管平滑肌細(xì)胞增殖等，對(duì)AS的發(fā)展過(guò)程中起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具有積極生理意義。本實(shí)驗(yàn)證明，姜黃素脂質(zhì)納米粒對(duì)于TNF-α引發(fā)的炎癥損傷作用下細(xì)胞分泌NO是有積極作用的。

同時(shí)，粘附分子表達(dá)量的降低，促使單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜轉(zhuǎn)移是動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期階段。ICAM-1（CD54）屬于免疫球蛋白超家族粘附分子，是一種單鏈跨膜糖蛋白，在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定粘附中發(fā)揮重要作用。若在炎癥環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量上升，則血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步向血管周圍浸潤(rùn)，組織的炎癥和相應(yīng)的損害逐步加重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新劑型通過(guò)影響對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的分泌抑制病情的惡化，發(fā)揮藥用作用。

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