程 靜 章正祥★ 陳 強(qiáng) 邵敏峰 周會霞 唐毅華 侯 群

不安腿綜合征（RLS）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要表現(xiàn)為休息或安靜時下肢感覺不適，夜間尤其劇烈，需要或強(qiáng)迫性活動下肢以緩解癥狀［1］。睡眠期間周期性腿部運(yùn)動（PLMS）是RLS中最重要的客觀發(fā)現(xiàn)［2］。既往研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)間腦多巴胺神經(jīng)元受損時能夠?qū)е翿LS感覺癥狀的發(fā)生。目前國內(nèi)外尚無理想的大鼠RLS動物模型。而本研究目的在于通過觀察6-羚基多巴胺（6-OHDA）毀損SD大鼠雙側(cè)間腦 A11核團(tuán)對大鼠行為學(xué)的影響，并評價使用該方法建立 RLS動物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD雄性大鼠21只，體重150g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2013-0016。6-OHDA H116（美國Sigma-Aldrich公司），L-抗壞血酸A5960（美國Sigma-Aldrich公司），小鼠抗大鼠TH單克隆抗體T1299（美國Sigma-Aldrich公司，山羊抗小鼠 IgG/HRP 聚合物PV-6002（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。腦立體定位儀ALC-H（上海奧爾科特生物科技有限公司），微量注射泵ALC-IP 600（上海奧爾科特生物科技有限公司）。10μl微量進(jìn)樣器（針頭錐形，針尖外徑0.5mm，針長51mm，上海高鴿工貿(mào)有限公司），高清攝像機(jī)HC-V210M（日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社），冰凍切片機(jī)HM 550（德國美康儀器設(shè)備有限公司），顯微成像系統(tǒng)DS-U2（日本尼康公司）等。

1.2 下丘腦毀損手術(shù) 21只SD雄性大鼠經(jīng)過20d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，根據(jù)體重將所有動物完全隨機(jī)分成三組，分別為空白組3只，假手術(shù)組9只，毀損組9只。用1%的戊巴比妥（6ml/kg）麻醉后，開始進(jìn)行間腦A11毀損手術(shù)。調(diào)整微量進(jìn)樣器距針尖8.0mm段與定位儀平面垂直，并用75%酒精消毒，固定于腦立體定位儀上。頭部消毒后，切開頭皮和筋膜，鈍性剝離骨膜，暴露前囟和人字點，通過調(diào)整門齒桿到耳桿下（4.5±1.0）mm來達(dá)到顱平位（前囟與人字點水平高度相差0.1mm以下），對兩側(cè)A11進(jìn)行定位鉆孔（前囟尾側(cè)3.0mm，腹側(cè)8.0mm，矢狀縫旁開0.5mm）［3］。微量注射器以2mm/min的速度進(jìn)針，進(jìn)至目標(biāo)深度后停留5min，再以1μl/min的速度緩慢給藥，毀損組注射4μl 0.2%6-OHDA（含0.1%維生素C），假手術(shù)組注射4μl 0.1%維生素C生理鹽水，停留10min，接著以2mm/min的速度退針，最后用碘伏消毒并縫合傷口?？瞻捉M不進(jìn)行任何處理。

1.3 行為學(xué)觀察及評價 術(shù)后第8天將大鼠放入測試籠中，從9：00～9：30am開始用高清攝像機(jī)錄制6h視頻。統(tǒng)計3h站立、爬籠、入睡次數(shù)及總時間［4］。（1）站立：用雙后肢站立，雙前肢無任何支撐，但并不代表身體和箱底垂直，身體完全伸展和不完全伸展均為站立，爬籠后雙肢均抬離桶壁后重新記作站立。站立時間：開始站立至任一前肢接觸箱體的時間。（2）爬籠：保持直立的姿勢靠在箱壁上，包括單個前肢和雙前肢接觸箱壁，直立后單肢或雙肢觸及桶壁后重新記作爬籠。爬籠時間：開始爬籠至雙前肢均離開箱壁的時間。（3）睡眠：閉目并且俯臥著，全身（包括頭部、鼻毛等）保持不動≥30s。睡眠時間：開始入睡至清醒的時間。1.4 取材 各組大鼠在視頻錄制結(jié)束后予1%戊巴比妥鈉（5ml/kg）麻醉，取腹主動脈血5ml，離心取血清2ml于-20℃儲存?zhèn)溆?，將動物仰臥位固定，開胸用灌流針行左心室穿刺，至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水200～300ml，至右心耳流出澄清液體，然后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液200～300ml，先快后慢灌注，至上肢、頸部僵直，即固定完成，灌注后取大鼠腦組織，在4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液中再固定12～24h，然后用4℃30%蔗糖-PBS液脫水72h，擦干表面液體，鋁箔紙包裹，于液氮中速凍10～15s左右，存于-80℃冰箱。

1.5 免疫組化 根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）對下丘腦A11進(jìn)行定位。在-20℃的恒溫箱中連續(xù)切片，厚度為30μm，每只大鼠取26～28張進(jìn)行染色，染色方法為漂片染色法。所有A11切片在同一物鏡（×4）下用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行照片采集。剔除只含黑質(zhì)、A13等部位的切片，最終每只大鼠取12張切片，人工計數(shù)A11部位酪氨酸羥化酶（TH）多巴胺神經(jīng)元的數(shù)目，并分左右進(jìn)行統(tǒng)計。A11多巴胺能神經(jīng)元呈三角形或多極狀，有較長的突起［5］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)計量資料以（x±s）表示，非正態(tài)計量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗法；若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，≥3組采用單因素方差分析，若方差不齊，采用Games-Howell檢驗，組間比較采用SNK法；兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗。方差不齊者，≥3組采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis法，其中兩兩比較采用所有成對比較法；兩組組間比較采用非參數(shù)檢驗的Mann-Whitney U檢驗，精確方法。各組資料均以α=0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 間腦A11 TH免疫組化結(jié)果 TH是多巴胺（DA）合成的限速酶，是神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志，注射6-OHDA會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的死亡。TH表達(dá)于胞漿內(nèi)，呈棕黃色，A11多巴胺神經(jīng)元的胞體和突起均有表達(dá)，模型組雙側(cè)A11經(jīng)過6-OHDA注射后，TH表達(dá)明顯減少。A11從下丘腦背側(cè)區(qū)（DA）的后端延伸至導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的最前端，其嘴側(cè)主要位于乳頭體丘腦束（mt）的內(nèi)側(cè)，是TH陽性細(xì)胞分布最為密集的區(qū)域，越靠近尾側(cè)，TH表達(dá)越少。人工計數(shù)法統(tǒng)計A11部位TH陽性表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)量，每個樣本統(tǒng)計12張，見表1。毀損組左側(cè)A11 TH陽性細(xì)胞總共有（114±23）個，明顯低于假手術(shù)組左側(cè)（150±22）個和正常組左側(cè)（169±14）個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。毀損組右側(cè)A11 TH陽性細(xì)胞共有（102±20）個，明顯低于假手術(shù)組右側(cè)（147±22）個和空白組右側(cè)（155±21）個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組左側(cè)TH陽性表達(dá)數(shù)與正常組左側(cè)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組右側(cè)A11 TH陽性表達(dá)數(shù)與空白組右側(cè)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。單側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量=12張切片同側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量之和，毀損率=1-單側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量/空白組同側(cè)A11多巴胺神經(jīng)元數(shù)量的均值，統(tǒng)計得到毀損組與假手術(shù)組毀損率見表2。毀損組左側(cè)毀損率有（32.28%±13.87）%，明顯高于假手術(shù)組左側(cè)（11.07%±13.04）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），毀損組右側(cè)毀損率有（33.76%±12.92）%，明顯高于假手術(shù)組右側(cè)（4.89%±14.09）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖 1～3。

表1 間腦A11雙側(cè)毀損TH陽性細(xì)胞表達(dá)比較［個，（±s）］

表1 間腦A11雙側(cè)毀損TH陽性細(xì)胞表達(dá)比較［個，（±s）］

注：與毀損組比較，*P＜0.05

組別 n 左 右空白組 3 169±14* 155±21*假手術(shù)組 9 150±22* 147±22*毀損組 9 114±23 102±20 F值 - 9.577 12.878 P值 - 0.001 0.000

表2 間腦A11雙側(cè)毀損TH毀損率比較［%，（±s）］

表2 間腦A11雙側(cè)毀損TH毀損率比較［%，（±s）］

組別 n A11左側(cè) A11右側(cè)假手術(shù)組 9 11.07±13.04 4.89±14.09毀損組 9 32.28±13.87 33.76±12.92 t值 -3.342 -4.531 P值 0.004 0.000

2.3 行為表現(xiàn)觀察結(jié)果 術(shù)后第8天，將大鼠放入桶中，用高清攝像機(jī)錄制6h視頻。記錄下3h的爬籠、站立及睡眠出現(xiàn)的次數(shù)及每次持續(xù)的時間，并統(tǒng)計前3h爬籠、站立、睡眠次數(shù)及總時間。分析后發(fā)現(xiàn)3h內(nèi)各個行為次數(shù)及總時間均無明顯差異。見表3。

表3 間腦A11雙側(cè)毀損行為學(xué)變化組間比較［（±s，M（Q）］

表3 間腦A11雙側(cè)毀損行為學(xué)變化組間比較［（±s，M（Q）］

組別 爬籠次數(shù)(次) 爬籠時間(s) 站立次數(shù)(次) 站立時間(s) 睡眠次數(shù)(次) 睡眠時間(s)空白組 123±40.51 506±137.96 128.67±33.56 468.33±157.15 10.67±3.21 813.67±199.04組 98.78±64.21 481.67±427.48 83.89±79.24 407.11±387.57 10.00(45.00)843.00(3467.50) 137.22±73.95 889.56±618.44 59.89±53.19 262.78±208.86 18.00(23.50)1425.56±818.93 0.755 1.641 1.304 0.785 - -0.480 0.220 0.300 0.470 0.791 0.568

圖1-1 正常組A11（物鏡×4）

圖1-2 正常組A11左側(cè)（物鏡×10）

圖1-3 正常組A11右側(cè)（物鏡×10）

圖2-1 假手術(shù)組A11（物鏡×4）

圖2-2 假手術(shù)組A11左側(cè)（物鏡×10）

圖2-3 假手術(shù)組A11右側(cè)（物鏡×10）

圖3-1 毀損組A11（物鏡×4）

圖3-2 毀損組A11左側(cè)（物鏡×10）

圖3-3 毀損組A11右側(cè)（物鏡×10）

3 討論

長期臨床觀察研究顯示RLS患者無帕金森樣癥狀，但在長期應(yīng)用多巴胺能藥物治療期間，帕金森患者RLS的累積發(fā)病率出現(xiàn)下降［6］，說明RLS的發(fā)生與多巴胺有關(guān)。間腦A11核團(tuán)是脊髓多巴胺唯一來源，因此推測RLS的發(fā)生與間腦A11的受累與多巴胺的減少密切相關(guān)。

本研究在Ondo等［4］研究的基礎(chǔ)上，增加樣本量，對大鼠雙側(cè)間腦A11核團(tuán)進(jìn)行立體定向毀損，并進(jìn)一步細(xì)化行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，采用統(tǒng)計站立、爬籠、睡眠次數(shù)和時間評價其行為學(xué)，免疫組化結(jié)果顯示A11毀損組TH毀損率明顯高于假手術(shù)組，說明間腦A11毀損成功。行為學(xué)結(jié)果顯示模型組總的爬籠次數(shù)、爬籠時間有增多，但并無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

以往6-OHDA毀損間腦A11相關(guān)研究顯示，對A11毀損模型尚未形成統(tǒng)一的行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，難以客觀評價大鼠的感覺異常。本實驗結(jié)果可能由于行為學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)中某些指標(biāo)并不能反映大鼠的感覺異常，行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步改善和細(xì)化，例如將爬籠行為細(xì)分為單肢爬籠和雙肢爬籠，站立行為細(xì)分為身體完全伸展并垂直于箱底的站立（直立）和身體不完全伸展的站立。在觀察大鼠行為學(xué)過程中發(fā)現(xiàn)，大鼠睡眠中可出現(xiàn)身體擺動，而RLS常可表現(xiàn)睡眠中周期性肢體動作，觀察指標(biāo)中加入不動行為（即在睡眠中≥2s四肢及全身保持完全不動的次數(shù)及時間），可評估這一臨床表現(xiàn)。另外，在行為觀測過程中將大鼠放入透明玻璃箱中，利用鏡面反射拍攝箱底，則能觀察大鼠在睡眠過程中的肢體活動，更能反映PLMS患者在休息時腿部的異常感覺。為了完善本研究，建議今后的實驗還可使用儀器監(jiān)測24h運(yùn)動活性、肌電圖、腦電圖評價生理指標(biāo)，更加客觀地評價大鼠的感覺異常。因此，6-OHDA定向毀損SD大鼠雙側(cè)間腦A11，是否能作為RLS動物模型還需要進(jìn)一步實驗。

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