高曉鵬，魯貴生

新樂市中醫(yī)醫(yī)院骨傷二科，河北 新樂 050700

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥為主要病變的自身免疫性疾病[1]，滑膜成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要細(xì)胞之一。活化的滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)具有永生化、侵襲性、腫瘤樣特性，通過形成血管翳直接侵襲關(guān)節(jié)軟骨并可釋放大量的促炎因子[2～3]。RA滑膜增生是其主要病理變化，研究發(fā)現(xiàn)，這與滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖有關(guān)，亦與其極低的凋亡率有關(guān)，滑膜襯里層成纖維細(xì)胞的凋亡率為零，導(dǎo)致滑膜襯里層不斷增厚，由正常的1～3層變?yōu)?～6層甚至更多，這表明滑膜成纖維細(xì)胞增殖與其凋亡減少有關(guān)[4]。中醫(yī)認(rèn)為，RA屬于痹癥范疇，獨活寄生湯源自唐代孫思邈的《備急千金要方》，由獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃15味中藥組成，具有祛風(fēng)止痛、補益肝腎氣血的功效[5]，臨床用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常見奇效，但對其具體的治療機制尚不明確。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是一種免疫制劑刺激形成的免疫亢進性關(guān)節(jié)炎，與人RA的形成及表現(xiàn)有類似之處。本研究通過建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察獨活寄生湯含藥血清對RA-FLS增殖和凋亡的影響，為獨活寄生湯治療RA的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，65只，體質(zhì)量200～220 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2013-1003，合格證編號：1305107。河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房飼養(yǎng)和實驗，溫度為22～25℃，自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 主要試劑與儀器 獨活寄生湯生藥材由本院藥劑科提供，經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)專家趙丁教授鑒定為正品。按原方比例，常規(guī)水煎煮3次后將藥液合并過濾，60℃水浴濃縮得到總生藥濃度為6.0 g/mL藥液，4℃保存?zhèn)溆?。弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司；CCK8試劑盒購于日本同仁；RNA提取試劑及PrimerScriptRT reagent Kit With DNA Eraser試劑盒和PCR所需試劑均購自TaKaRa公司；大鼠Bax、Bcl-2、caspase3 ELISA檢測試劑盒購于美國eBioscience；其余試劑均為國產(chǎn)分析級，購于天津大茂。超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱(日本，三洋公司)；低速離心機(美國Beckman公司)；GeneAmp PCR System 2400型PCR儀(美國ABI公司)；DU730紫外分光光度計(美國Beckman公司)；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Tanon-1600型UVP成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3 模型的建立及含藥血清的制備 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、甲氨喋呤組、獨活寄生湯高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其他各組參考文獻復(fù)制動物模型，造模第1天足跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL，正常組注射相應(yīng)體積生理鹽水[6]。注射后第8天，獨活寄生湯高、中、低劑量組分別灌胃獨活寄生湯3.0、1.5、0.75 g/kg，甲氨喋呤組每天灌胃甲氨喋呤0.5 g/kg，正常組和模型組給予相應(yīng)體積生理鹽水，每天2次，連續(xù)給藥20天。末次給藥12 h無菌條件下腹主動脈采血，室溫靜置2 h后，4℃、2 000 rpm離心15 min后取上清，56℃水浴滅活后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 滑膜成纖維細(xì)胞分組及培養(yǎng)方法 細(xì)胞分為6組，滑膜成纖維細(xì)胞參考文獻通過組織貼壁法[7]獲得，分別是空白組、模型組、甲氨喋呤組、獨活寄生湯高、中、低劑量組。其中空白組為正常大鼠滑膜成纖維細(xì)胞，其余各組均為模型組大鼠滑膜成纖維細(xì)胞，空白組和模型組給予20%正常大鼠血清培養(yǎng)；甲氨喋呤組給予20%甲氨喋呤組大鼠含藥血清培養(yǎng)；獨活寄生湯高劑量組給予20%獨活寄生湯高劑量組大鼠含藥血清培養(yǎng)；獨活寄生湯中劑量組給予20%獨活寄生湯中劑量大鼠含藥血清培養(yǎng)；獨活寄生湯低劑量組給予20%獨活寄生湯低劑量大鼠含藥血清培養(yǎng)。

1.5 CCK8法檢測FLS增殖 使用CCK8試劑盒，按說明書操作，檢測細(xì)胞增殖率，將上述各組FLS接種于96孔板中，5×103個/孔，每組有5個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)后的24、48、72 h使用酶標(biāo)儀測定OD450的A值。增殖抑制率=[(A空白組－A給藥組)/A空白組]×100%。

1.6 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA的表達 按上述1.4方法獲取各組FLS細(xì)胞并接種于6孔板中，5×104個/mL，每孔2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，上清用于后續(xù)ELISA檢測，收集的細(xì)胞運用Trizol法提取總RNA。超微量測定儀測定RNA的濃度和純度，濃度在1.5～2.0 g/L；OD260/OD280在1.8～2.0之間。以獲得的RNA為模板，按試劑盒說明書合成cDNA，隨后進行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，觀察Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表達情況。Bax引物序列如下：上游5′-ATCCCGCCCACTTTCTAC-3′，下游 5′-GCTCAAT CCGTTGTTCAGG-3′；Bcl-2引物序列如下：上游5′-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3′，下游 5′-CCCTAA GCCCCCAATTCTCT-3′；caspase3引物序列如下：上游 5′-TATGCCAACACAGTGTTGTCTGG-3′，下游 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′；GAPDH 引物序列如下：上游5′-GAAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存產(chǎn)物。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率的一致性，選用2-△△Ct法分別計算Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA的相對表達量。

1.7 ELISA法檢測Bax、Bcl-2和caspase3蛋白的表達 將上述1.6中收集的細(xì)胞上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測各組Bax、Bcl-2和caspase3的表達情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以(±s)表示，組間的兩兩比較用單因素方差分析及LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞各時間點增殖抑制率結(jié)果比較 見表1?？瞻捉M細(xì)胞在各時間點未見明顯的變化；模型組細(xì)胞隨時間延長，增殖抑制率升高(P＜0.05)；甲氨喋呤組和獨活寄生湯高、中、低劑量組細(xì)胞隨干預(yù)時間的延長，增殖抑制率降低(P＜0.05)。與空白組比較，模型組細(xì)胞在各時間點的增殖抑制率均升高(P＜0.05)；與模型組比較，甲氨喋呤組和獨活寄生湯各劑量組細(xì)胞在各時間點的增殖抑制率均降低(P＜0.05)，尤以高劑量組的降低更為明顯。

表1 各組細(xì)胞各時間點增殖抑制率結(jié)果比較(±s) %

表1 各組細(xì)胞各時間點增殖抑制率結(jié)果比較(±s) %

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與獨活寄生湯低劑量組比較，③P＜0.05；與獨活寄生湯中劑量組比較，④P＜0.05；與同組前一時間點比較，⑤P＜0.05

組 別空白組模型組甲氨喋呤組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組n 5 5 5 5 5 5 2 4 h 2 1.1 7±3.1 3 7 0.2 9±6.5 8①5 6.7 7±8.4 2②6 8.8 7±3.4 2②5 9.1 7±7.8 4②③4 8.6 5±5.5 1②③④4 8 h 1 9.2 0±4.6 3 7 2.2 7±9.1 1①⑤4 8.3 5±6.5 1②⑤6 3.2 9±4.5 6②⑤5 3.2 0±6.3 5②③⑤4 2.1 2±5.5 8②③④⑤7 2 h 1 9.2 4±3.6 2 7 6.4 3±5.0 3①⑤4 2.8 9±2.4 3②⑤6 0.4 5±7.1 6②⑤4 9.4 1±4.3 8②③⑤3 6.0 9±3.2 7②③④⑤

2.2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表達水平比較 見表2。與空白組比較，模型組Bax、caspase3 mRNA水平降低，Bcl-2 mRNA水平升高(P＜0.05，P＜0.01)。與模型組比較，甲氨喋呤組和獨活寄生湯中、高劑量組Bax、caspase3 mRNA水平升高，Bcl-2 mRNA水平降低(P＜0.05，P＜0.01)，高劑量組的作用更為明顯。

2.3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表達比較見表3。與空白組比較，模型組Bax、caspase3蛋白含量降低，Bcl-2蛋白含量升高(P＜0.05，P＜0.01)；與模型組比較，甲氨喋呤組和獨活寄生湯中、高劑量組Bax、caspase3蛋白含量升高，Bcl-2蛋白含量降低(P＜0.05，P＜0.01)，高劑量組的作用最為明顯。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要的病理改變之一是滑膜襯里層的增厚，其主要原因是滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖和凋亡的減少。本研究采用弗氏完全佐劑成功建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，分離滑膜成纖維細(xì)胞，進而采用獨活寄生湯含藥血清進行干預(yù)，觀察其對滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為獨活寄生湯用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供進一步的實驗依據(jù)。

表2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表達水平比較(±s)

表2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表達水平比較(±s)

組 別空白組模型組甲氨喋呤組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組n 5 5 5 5 5 5 B a x/G A P D H 2.6 4 7±0.1 0 4 1.1 1 7±0.1 2 1②1.8 5 7±0.1 1 2③1.3 5 6±0.0 8 8 1.6 3 1±0.0 9 2③1.9 8 5±0.1 3 4③⑤B c l-2/G A P D H 2.8 9 6±0.1 2 5 3.3 6 7±0.1 3 4①2.5 5 6±0.1 0 1③2.9 7 8±0.0 8 2 2.5 8 6±0.0 9 5③⑤2.4 3 1±0.1 2 1④⑤c a s p a s e 3/G A P D H 3.8 7 3±0.1 6 7 1.9 4 3±0.0 7 8②3.3 6 7±0.1 7 3③2.2 5 3±0.0 9 6 2.9 8 7±0.1 5 8③⑤3.5 6 5±0.0 9 7③⑤

與空白組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與獨活寄生湯低劑量組比較，⑤P＜0.05

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表達比較(±s)ng/mL

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表達比較(±s)ng/mL

與空白組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與獨活寄生湯低劑量組比較，⑤P＜0.05

組 別空白組模型組甲氨喋呤組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組n 5 5 5 5 5 5 B a x 4 5.2 9±0.4 6 2 9.6 2±0.5 8②3 7.3 9±0.9 1③3 2.0 6±0.4 2 3 8.2 3±0.9 5③4 2.9 4±1.1 1③⑤B c l-2 5 1.9 1±0.6 3 7 1.9 1±1.7 3①5 6.6 3±0.5 3③6 6.0 9±0.8 2 5 4.7 6±0.5 5⑤5 1.7 2±0.5 8④⑤c a s p a s e 3 4 9.8 1±0.6 7 3 1.6 5±0.7 8②3 9.4 2±0.7 3③3 1.6 6±0.5 6 3 8.7 5±0.5 8③4 7.7 2±0.4 7③⑤

本研究首先選用CCK8法觀察獨活寄生湯含藥血清對FLS的增殖影響。CCK8法的基本原理是試劑中的WST-8可被活細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚物質(zhì)，顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組FLS的增殖抑制率明顯升高，而與模型組比較，獨活寄生湯含藥血清干預(yù)下的FLS增殖抑制率明顯降低，說明獨活寄生湯能夠有效抑制滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖，且呈劑量依賴性。

滑膜成纖維細(xì)胞的異常凋亡減少是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎滑膜增厚的另一原因。細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的、受多基因調(diào)控的主動程序化死亡過程，在該過程中Bcl-2家族發(fā)揮重要作用。Bcl-2家族分為兩大類，一是抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-XL等；另一類是促凋亡基因，如Bax、Bad、Bak等。Bcl-2與Bax形成二聚體，導(dǎo)致Bcl-2的抗凋亡作用受到抑制，因此兩者表達水平的相對比值是判斷細(xì)胞凋亡或存活的重要指標(biāo)，Bax比例增高，促進細(xì)胞凋亡，Bcl-2比例增高，則抑制細(xì)胞凋亡[8～10]。caspase3是位于Bcl-2與Bax下游的凋亡執(zhí)行者，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜細(xì)胞過度表達 Bcl-2、p53、p21及c-myc，而正常人滑膜細(xì)胞中這些蛋白均不表達，說明RA患者滑膜增殖可能是由于FLS中過度表達Bcl-2等抗凋亡基因?qū)е碌蛲霾蛔闼耓10]。本研究通過檢測FLS中Bax、Bcl-2、caspase3 mRNA和蛋白表達，探討?yīng)毣罴纳鷾欠裢ㄟ^促進FLS凋亡來發(fā)揮治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，模型組的Bcl-2表達升高，Bax表達降低，提示關(guān)節(jié)炎模型確實是通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達來實現(xiàn)FLS增殖的。獨活寄生湯中、高劑量干預(yù)后促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達，進而達到促進凋亡的作用。本研究已初步揭示獨活寄生湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的部分作用機制，但其具體的信號通路尚未清楚，后續(xù)研究還需進一步研究其具體機制。

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