蔣會兵，孫云南，李梅，戴偉東，宋維希，田易萍，夏麗飛，陳林波*

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紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素積累及合成相關基因的表達

蔣會兵1，孫云南1，李梅1，戴偉東2，宋維希1，田易萍1，夏麗飛1，陳林波1*

1. 云南省農業(yè)科學院茶葉研究所，云南省茶樹種質資源創(chuàng)新與配套栽培技術工程研究中心，云南省茶學重點實驗室，云南 勐海 666201； 2. 中國農業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

為明確紫娟茶樹（cv. Zijuan）葉片發(fā)育中花青素積累特性及合成途徑上相關基因的表達特點，利用液質聯(lián)用法（HPLC-MS）、轉錄組測序（RNA-Seq）和數(shù)字基因表達譜技術（DGE），分析了紫娟茶樹芽、第二葉、開面葉和成熟葉4個發(fā)育期花青素的種類、含量及合成相關基因的表達水平。結果表明，花青素積累量隨葉片發(fā)育先增加后減少，第二葉含量最大（9.87?mg·g-1）、成熟葉含量最小（0.11?mg·g-1），與葉色表現(xiàn)相吻合。結構基因在芽、第二葉和開面葉高表達，在成熟葉下調表達；和表達模式相似，表達量均隨葉片發(fā)育而降低，在芽期高表達，在成熟葉全部下調表達；在第二葉上調表達，在成熟葉下調表達，與花青素積累情況一致；在各發(fā)育期均有上調和下調表達。和表達模式相似，在第二葉、開面葉和成熟葉上調表達；和表達模式相似，在芽、第二葉和開面葉高表達，在成熟葉下調表達。和在各發(fā)育期均有上調或下調表達。說明紫娟茶樹葉片不同發(fā)育階段結構基因和調控基因的表達水平不同，導致花青素積累存在差異，具有一定的時間表達特異性。

茶樹品種；花青素；數(shù)字表達普；差異表達基因

茶葉因其保健無副作用、消費群體龐大等因素成為世界三大飲料之一。紫娟茶樹品種（cv.）的新梢和嫩葉富含大量花青素而呈紫色，是天然食用色素的重要來源，近年在飲料、保健等方面?zhèn)涫荜P注[1-2]。然而在紫娟茶樹葉片在發(fā)育過程中呈現(xiàn)出由紫轉綠的表型變化，所積累的花青素隨著幼葉的發(fā)育而變化，導致花青素、兒茶素等內含物質含量降低，從而影響茶葉品質[3-4]。因此，了解紫娟茶樹品種芽葉色澤變化的分子機制變得迫切需要。

目前已將基因芯片、高通量測序和蛋白質組分析等技術應用到茶樹研究領域，探索了與茶樹葉片花青素生物合成相關酶基因（的表達情況，并進行了功能注釋[5-7]，篩選克隆出茶樹轉錄調控因子[8-9]，分析了茶樹紫葉與綠葉的差異表達蛋白[10]，這為茶樹基因組學和代謝組學的研究奠定了基礎。茶樹葉片花青素的合成、積累和降解隨葉片發(fā)育而變化，受時間、空間和內外因子的影響，其調控機理目前尚不完全明確[11]。本研究基于實驗室前期對紫娟茶樹品種轉錄組測序結果[12]，應用數(shù)字基因表達譜技術分析了紫娟茶樹葉片從頂芽到成熟葉的生長發(fā)育過程中花青素合成相關基因表達情況，為揭示茶樹葉片花青素合成及性狀控制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料為于云南省農業(yè)科學院茶葉研究所品種園采集的紫娟茶樹葉片。根據(jù)葉片生長發(fā)育順序，將其分為4個發(fā)育期：ZJ_1為單個頂芽，色澤紫色；ZJ_2為一芽二葉期的第二葉，色澤深紫色；ZJ_3為芽形成駐芽時期的開面葉片，色澤紫紅色；ZJ_4為成熟葉片，色澤深綠色（圖1）。2015年10月，采集同一植株各發(fā)育期樣品，一部分微波固樣，做代謝物檢測；一部分液氮固樣，–80℃冰箱保存，做轉錄組分析。

1.2 花青素組分及含量分析

參照文獻[13]的方法，利用Agilent 1100液相色譜和離子阱質譜聯(lián)用分別測定各樣品的花青素組分和含量。稱取0.2?g樣品，加10?mL 20%酸性乙醇（含0.1%鹽酸），超聲波提?。?0?kHz，20?min，室溫），離心取上清液（8?000?r·min-1，10?min），沉淀物重復2次，合并上清液（30?mL），旋轉蒸發(fā)（45℃），3%甲醇定容至5?mL，SPE柱凈化，復溶（2?mL 0.1%鹽酸水溶液），過濾膜（0.45?μm）后測定。每個樣品重復3次。流動相A相為0.1%甲酸-水溶液，B相為100%乙腈，進樣量5?μL，流速0.3?mL·min-1，柱溫40℃，掃描范圍（200~650?m/z），干燥氣體（N2，12?L·min-1，350℃），噴霧氣壓（30?psi），毛細管電壓（3?500?V）。

1.3 RNA提取與文庫構建

選用CTAB-LiC1方法[14]提取各樣品的總RNA，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度及有無污染，Nanodrop檢測RNA純度，Qubit定量RNA濃度，Agilent 2100檢測RNA完整性。cDNA文庫構建與測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，通過Illumina Hiseq 2500的測序平臺，得到原始讀序（Raw reads），經過濾得到干凈讀序（Clean reads），利用Trinity軟件通過序列之間的重疊信息組裝得到重疊群（Contigs），局部組裝得到轉錄本（Transcripts），用Tgicl和Phrap軟件對Transcripts進行同源聚類和拼接得到單基因簇（Unigene）。

1.4 差異基因分析

利用Rsem軟件的Bowtie2將Trinity拼接得到的轉錄組作為參考序列（Ref），將每個樣品的Clean reads往Ref上繪制Mapping。采用TMM對Read count數(shù)據(jù)進行標準化處理，利用DEGseq對差異表達基因進行差異表達分析。按照FPKM法計算差異基因的表達量，篩選閾值小于0.005以及|log2Fold change|>1；對于差異基因，如果其log2Fold change>0，認為是上調表達，反之，認為是下調表達。

2 結果與分析

2.1 葉片發(fā)育中花青素組分和含量分析

通過HPLC-MS分析，從紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期樣品中共檢測到7種花青素苷衍生物組分（表1），分別為飛燕草-3--半乳糖苷（D3Ga）、矢車菊素-3--半乳糖苷（C3Ga）、天竺葵-3--葡萄糖苷（P3G）、芍藥素（Peon）、天竺葵色素（Pela）、飛燕草-3--(6-香豆酰)-半乳糖苷（DCZGa）和矢車菊素-3--(6-香豆酰)-半乳糖苷（CCZDGa）。其中DCZGa、CCZDGa和C3Ga 3種組分含量在芽、第二葉和開面葉中均較高，成熟葉各組分含量極少或未檢出?；ㄇ嗨乜偭侩S葉片發(fā)育先增加后減少，在第二葉達高峰值，為9.87?mg·g-1，芽和開面葉含量分別為3.03?mg·g-1和3.41?mg·g-1，成熟葉最低，僅有0.11?mg·g-1。第二葉與成熟葉花青素含量相差近90倍，芽和開面葉花青素含量相差不大。可見，紫娟茶樹葉片花青素積累量主要來源于DCZGa、CCZDGa和C3Ga，不同發(fā)育期花青素含量變化趨勢與葉片色澤表現(xiàn)相吻合。

2.2 葉片發(fā)育中基因差異表達分析

對紫娟茶樹芽、第二葉、開面葉和成熟葉4個時期樣品進行轉錄組測序，共篩選出242?757條基因系列（Unigene），其總長度126.51?Mb、最大長度14?589?bp、平均長度521?bp、N50為637?bp，KEGG富集分析得到284個代謝通路。將相連兩個發(fā)育期進行比對，即第二葉/芽（ZJ_2 vs ZJ_1）、開面葉/第二葉（ZJ_3 vs ZJ_2）、成熟葉/開面葉（ZJ_4 vs ZJ_3），篩選不同發(fā)育期的差異表達基因（圖2）。在ZJ_2 vs ZJ_1中獲得1?108條差異表達基因，其中上調基因數(shù)457條，主要涉及光合作用、氨基酸代謝、脂質代謝、萜類和酮類化合物代謝等128個通路；下調基因數(shù)651條，主要涉及核糖體代謝、細胞周期和嘧啶代謝等159個通路。在ZJ_3 vs ZJ_2中獲得639條差異表達基因，其中上調基因數(shù)321條，主要涉及苯丙素合成、光合作用、氮代謝、葡萄糖醛酸轉換和碳代謝等99個通路；下調基因數(shù)318條，主要涉及細胞周期、DNA的復制、細胞減數(shù)分裂和p53信號等95個通路。在ZJ_4 vs ZJ_3中獲得1?889條差異表達基因，其中上調基因數(shù)892條，主要涉及光合作用、光合生物固碳、氮代謝和類胡蘿卜素生物合成等216個通路；下調基因數(shù)997條，主要涉及黃酮類合成、苯丙素生物合成、苯丙氨酸代謝、淀粉與蔗糖代謝、黃酮和黃酮醇生物合成等214個通路。對類黃酮生物合成途徑中57條差異表達基因進行NCBI系列比對，被注釋為苯丙氨酸解氨酶（）、肉桂酸羥化酶（）、4-香豆酰CoA連接酶（）、查耳酮合成酶（）、查耳酮異構酶（）、黃烷酮3-羥化酶（）、類黃酮3'-羥化酶（）、類黃酮3',5'-羥化酶（）、黃酮醇合成酶（）、二氫黃酮醇-4-還原酶（）和花色素合成酶（）等11種酶基因。

注：ZJ_1：芽，紫色；ZJ_2：第二葉，深紫色；ZJ_3：開面葉，紫紅色；ZJ_4：成熟葉，深綠色。下同。

表1 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素組分及含量

注：“—”表示未檢測到。

Note: “—” indicates not detected.

圖2 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期差異基因的表達情況

2.3 葉片發(fā)育中花青素生物合成及調控基因的表達

2.3.1 葉片發(fā)育中花青素合成結構基因的表達

對紫娟茶樹葉片發(fā)育中花青素合成相關基因、、、、、、、、和表達情況分析表明（表2）?；蛑泄搏@得17條差異表達基因，其表達量在芽、第二葉和開面葉均有高峰值，在成熟葉均為最低，第二葉5條基因下調表達，開面葉3條基因上調表達，成熟葉全部下調表達。在、、和中共獲得18條差異表達基因，其表達量均隨葉片發(fā)育而減少，在芽期最高，成熟葉最低，表達模式基本一致，第二葉3條基因下調表達，開面葉3條基因下調表達，成熟葉全部下調表達。中獲得4條差異表達基因，表達量隨葉片發(fā)育先增加后減少，在第二葉達高峰值，為上調表達，在成熟葉最低，為下調表達，與花青素積累情況一致。中獲得4條差異表達基因，其中1條基因表達量隨葉片發(fā)育而減少，在第二葉和成熟葉下調表達；3條基因表達量在成熟葉增至最大，為上調表達。中獲得3條差異表達基因，表達量隨葉片發(fā)育而減少，第二葉2條基因下調表達，開面葉1條基因下調表達，成熟葉全部下調表達?？梢?，與花青素合成相關基因在紫娟茶樹葉片發(fā)育的4個時期均有表達，其中、、、、、、、、和基因的表達模式相似，在第二葉和開面葉部分基因下調表達，成熟葉全部下調表達，與花青素積累情況基本一致；基因的表達模式無變化規(guī)律，在各發(fā)育期存在上調或下調表達。

2.3.2 葉片發(fā)育中花青素合成修飾基因的表達

對紫娟茶樹葉片發(fā)育中糖基化轉移酶（）、酰基化酶（）、無色花色素還原酶（）及花色素還原酶（）相關基因表達檢測發(fā)現(xiàn)（表3）。類黃酮-3-葡糖基轉移酶、花青素3'--β-葡萄糖基轉移酶和花青素5,3--葡萄糖基轉移酶的表達量隨葉片發(fā)育逐漸增加，芽期最低、成熟葉最高，在第二葉、開面葉和成熟葉均為上調表達；花青素3--葡萄糖基轉移酶和花青素5--葡萄糖基轉移酶的表達量隨葉片發(fā)育先增加后減少，在第二葉上調表達，在開面葉和成熟葉下調表達，與花青素含量變化趨勢一致。花青素-5-芳族酰基轉移酶的表達量在成熟葉最高，為上調表達?；虮磉_量隨葉片發(fā)育而減少，第二葉2條基因下調表達，開面葉2條基因下調表達，成熟葉全部下調表達?；虮磉_量在芽、第二葉和開面葉高表達，成熟葉急劇降低，為下調表達?？梢姡暇瓴铇淙~片花青素合成修飾途徑中基因表達較復雜，其中和在成熟葉下調表達，與花青素積累情況一致，而和在成熟葉上調表達，與花青素積累情況相反。

2.3.3 葉片發(fā)育中花青素合成調控基因的表達

對花青素合成相關調控因子蛋白、蛋白和蛋白的表達情況檢測發(fā)現(xiàn)（表4），在中獲得6條差異基因，其中、和基因的表達量隨葉片發(fā)育而減少，在開面葉和成熟葉下調表達；、和基因的表達量隨葉片發(fā)育先增加后減少，在第二葉上調表達，成熟葉下調表達。中獲得7條差異基因，其中、和基因的表達量隨葉片發(fā)育而減少，在第二葉、開面葉和成熟葉下調表達；和基因的表達量隨葉片發(fā)育而增加，在成熟葉上調表達。中獲得7條差異基因，其中c中4條基因的表達量隨葉片發(fā)育而減少，在第二葉、開面葉和成熟葉下調表達；中3條基因在各時期的表達特征無變化規(guī)律，在芽、第二葉、開面葉和成熟葉均有上調和下調表達。整體而言，在紫娟茶樹葉片花青素合成調控途徑中基因和基因在不同發(fā)育期的表達特征與花青素含量變化情況基本一致，而基因在各時期均有上調或下調表達，存在與花青素積累情況相同或相反的表達模式。

表2 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素合成結構基因的表達

注：“up”為上調表達，“down”為下調表達，“—”為差異不顯著。

Note: “up” is up regulation expression, “down” is down regulation expression, “—”for the no significant difference.

表3紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素合成修飾基因的表達

Table 3 The expressions of later biosynthetic genes in different leaf positions in C. sinensis cv. Zijuan

注：“up”為上調表達，“down”為下調表達，“—”為差異不顯著。

Note: “up” represents up regulation expression, “down” represents down regulation expression, “—” indicates no significant difference.

表4 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素合成調控基因的表達

注：“up”為上調表達；“down”為下調表達；“—”為差異不顯著。

Note: “up” is up regulation expression;“down” is down regulation expression;“—”for the no significant difference.

3 討論

本文應用HPLC-MS技術，從紫娟茶樹芽、第二葉、開面葉和成熟葉樣品中檢測出7種花青苷衍生物，花青素主要積累在呈紫色的芽、第二葉和開面葉中，而成熟葉花青素的積累很少，很可能是茶樹幼嫩葉片易于花青素合成和積累。不同發(fā)育階段花青素含量變化趨勢與葉色表現(xiàn)相吻合，花青素的積累與DCZGa、CCZDGa和C3Ga三種組分密切相關，而與Peon和Pela兩種組分關系不大，這與解東超等[15]對紫娟鮮葉花青素含量測定結果基本一致。

前人的研究表明，基因的表達與兒茶素類化合物、花青素的累積呈正相關[16-17]。本研究表明，紫娟茶樹葉片發(fā)育中基因在芽、第二葉和開面葉高表達，在成熟葉下調表達，與花青素含量變化趨勢基本一致，說明基因在紫娟茶樹葉片花青素合成中起重要作用。、、、、、和等8個基因在時間上的表達模式相似，均在芽期高表達，第二葉和開面葉少數(shù)差異基因下調表達，成熟葉全部下調表達，而HPLC-MS檢測結果表明，第二葉花青素苷積累量最大，說明花青素的積累滯后于基因表達一個時期，這與菊花花瓣中花青素苷合成基因表達類似[18]，推測在紫娟茶樹葉片發(fā)育中可能存在基因表達先于花青素苷的合成。整體而言，這些花青素合成酶在呈紫色的芽和第二葉大量表達促進了花青素苷的生物合成，而在呈深綠色的成熟葉完全下調表達使花青素苷的積累量顯著降低。注釋到中的差異基因的表達量隨葉片發(fā)育先增加后減少，第二葉達高峰值，為上調表達，成熟葉最低，為下調表達，與花青素積累情況相吻合，說明與黃酮醇和花青素的合成密切相關，由此推測，可能通過底物競爭方式影響花青素苷合成，或生成黃酮醇等助色素改變紫娟茶樹葉片的色澤[19-20]。注釋到中的差異基因存在兩種不同的表達模式，可能分別是途徑中的兩個分支限速酶[21]，其功能有待進一步證實。

本研究表明，花青素3--葡萄糖基轉移酶和花青素5--葡萄糖基轉移酶在第二葉上調表達，在開面葉和成熟葉下調表達，與花青素積累量情況相吻合，說明這兩個基因在花青素的合成修飾途徑中起主要作用，可能是決定茶樹葉片花青素呈紫色的關鍵因子[22]。而類黃酮3--葡萄糖基轉移酶、花青素3'--β-葡萄糖基轉移酶、花青素5,3--葡萄糖基轉移酶和花青素5 -芳族?；D移酶的表達模式與花青素積累情況相反，其修飾功能有待進一步研究。和基因的表達模式相似，在芽、第二葉和開面葉高表達，在成熟葉下調表達，與花青素合成途徑中上游結構基因的表達模式基本一致，這可能是因為、分別參與兒茶素和表兒茶素的合成[23-24]，推測和在紫娟茶樹葉片原花青素的合成中起關鍵作用。

在紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期，和基因的表達水平與結構基因基本一致，推測可激活結構基因的表達而調控花青素的生物合成[25-26]。和在第二葉高表達，在成熟葉下調表達，與花青素積累情況一致，說明這兩個基因可能參與類黃酮合成途徑中結構基因的表達，促進花青素的積累[27-28]。和基因在成熟葉上調表達，與花青素積累情況相反，可能抑制花青素和類黃酮的積累[29-30]，推測基因可能起正調控和負調控作用。在第二葉、開面葉和成熟葉均為下調表達，與結構基因表達水平基本一致。在各發(fā)育期均有上調和下調表達，其作用機制有待進一步研究。

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Anthocyanin Accumulation and Expression of Synthesis-related Genes in Leaves of Different Developmental Stages incv. Zijuan

JIANG Huibing1, SUN Yunnan1, LI Mei1, DAI Weidong2, SONG Weixi1, TIAN Yiping1, XIA Lifei1, CHEN Linbo1*

1. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Matching Cultivation, Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to explore the regulatory factors and structural genes of anthocyanin biosynthesis in leaves of different developmental stages incv., anthocyanin contents and compositions were analyzed by high performance liquid chromatography-mass, and the expression of synthesis-related genes were tested by RNA-sequencing and digital gene expression (DGE) profiling technology. HPLC-MS analysis showed that the anthocyanin content was consistent with color changes, increased firstly and then decreased with the leaf positions of Zijuan, with the highest anthocyanin content in the second leaf (9.87?mg·g-1) and the lowest content in mature leaf(0.11?mg·g-1). DGE determination results showed that the expression levels ofgene were relatively high in bud,second leaf and open surface leaf, but low in mature leaf.andshoweda patternof declining expression asin different leaf positions of Zijuan.was firstly up-regulated in the second leaf and then declined in the mature leaf, which was consistent to the anthocyanin changes.showed no clear expression pattern.andexhibited similar expression patterns, which were up-regulated in the second, open surface and mature leaves.andshowed similar expression patterns, which were high in bud, second and open surface leaves, but low in mature leaf. The gene expression of,andshowed different expressionpatterns in different leaf positons of Zijuan. These results suggested that the temporal expression specificitiesof structural and regulatory genes may significantly affect the accumulation of anthocyanin in Zijuan.

tea cultivar,anthocyanin, digital expression patterns, differentially expressed genes

S571.1

A

1000-369X(2018)02-174-09

2017-10-16

2017-12-01

國家自然科學基金(31560220，31460216)、云南省人才培養(yǎng)計劃(2015HB105)

蔣會兵，男，副研究員，主要從事茶樹種質資源研究。

chenlinbo2002@sina.com