陳卓，毛祥,2，于華，唐平，黃丹，2*，趙長青,2

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢　643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室，四川 自貢　643000；3.四川工業(yè)科技學院 食品與服裝學院，四川 德陽　618500)

四川麩醋是我國一種著名的食醋，主要以麩皮等為原料，采用多菌種、生料固態(tài)發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝[1]。它以藥曲和黑曲作糖化劑，再加上醋母和麩皮拌和后入池，發(fā)酵主要靠環(huán)境中的微生物進行，其產品色澤黑褐、味道幽香、酸味柔和、體態(tài)澄清、可久存而不腐[2]。在食醋生產過程中，酵母菌、醋酸菌、霉菌、乳酸菌等都是優(yōu)勢菌，是主要的發(fā)酵劑[3]。因此，研究乳酸菌的產酸特性可以為后期提高食醋的出醋率奠定基礎。目前，對食醋釀造過程中的乳酸菌的研究比較活躍，Xu Wei等[4]在對鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中菌系分布的研究中，發(fā)現乳酸菌和醋酸菌占主體地位。Wu Jiajia等[5]在研究山西老陳醋釀造過程中的菌系組成時，發(fā)現乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬是酒精發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢微生物。聶志強等[6]采用宏基因組學技術研究天津獨流老醋醋酸發(fā)酵過程中菌系組成，結果表明：隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌的豐度逐漸降低，但在整個發(fā)酵過程中乳酸菌的豐度遠高于其他細菌，說明乳酸菌可能對食醋風味形成具有重要作用。2014年趙國忠等從老陳醋酒醅中分離得到1株有利于食醋發(fā)酵的乳酸菌，通過菌株協同發(fā)酵，添加乳酸菌與未添加乳酸菌的醋醅進行比較，前者乳酸含量提高了2.1倍；發(fā)酵結束后，總酸含量前者為6.37 g/100 g，后者為5.36 g/100 g。但是對四川麩醋中乳酸菌的研究報道還比較少，研究麩醋醋醅中乳酸菌的產酸特性可為解析麩醋風味形成原因提供一些幫助。

本研究從四川麩醋醋醅中篩選出產酸能力較強的優(yōu)勢乳酸菌，進行分子鑒定，并對該菌株在不同發(fā)酵初始pH、溫度以及搖床轉速等條件下的產酸能力進行研究，為解決麩醋出醋率低的問題提供幫助。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗材料與試劑

醋醅，四川某傳統(tǒng)麩醋廠；CaCO3，HCl，NaOH，HOOCC6H4COOK等，以上藥品均為分析純。

1.1.2培養(yǎng)基

1.1.2.1分離培養(yǎng)基(MRS)

葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，吐溫80 1 mL，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸錳0.25 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，瓊脂20 g，碳酸鈣20 g，蒸餾水1 L。121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

在分離培養(yǎng)基的基礎上不添加瓊脂和碳酸鈣。

1.1.3儀器與設備

超凈工作臺、立式自動壓力蒸汽滅菌鍋、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、pH計、搖床、電子顯微鏡、移液槍、紫外可見分光光度計、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀。

1.2　方法

1.2.1菌株的分離純化

準確稱量25 g醋醅樣品，加入到裝有225 mL無菌水的錐形瓶中，震蕩搖勻。取1 mL接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，目的是富集菌體。再吸取1 mL富集后的菌液，以10倍濃度法梯度稀釋到10-7，然后再選取適當梯度的菌懸液并吸取1 mL于無菌培養(yǎng)皿中[7]，用含有2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基澆注[8]，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察。依據乳酸菌形態(tài)特征和透明圈大小挑取單菌落。把得到的單菌落多次分離純化，直至獲得純培養(yǎng)，經顯微鏡觀察確定為單菌落后接種到斜面，所得單菌落編號，保藏備用。

1.2.2菌株的復篩

分別將各分離菌株接種到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。再用pH計法測定其總酸，依據總酸的含量來篩選出其中產酸能力較強的菌株。

1.2.3分離菌株的分子生物學鑒定

為了提取分離菌株的DNA，本試驗主要采用凍融法[9]。

引物1(27f)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物2(1492r)：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

PCR反應體系(25 μL體系)：

DdH2O11

10×PCR緩沖液2.5

2.5 mmol/L dNTP2.0

25 mmol/L MgCl21.5

引物11.0

引物21.0

模板DNA5

Taq酶1

反應條件：

① 預變性95 ℃4 min

② 變性95 ℃45 s

③ 退火56 ℃45 s

④ 延伸72 ℃90 s

⑤ 終延伸 72 ℃1 min

重復②，③，④ 步驟35次，后再延伸1 min停止[10]。最后將擴增出的PCR產物進行測序。

1.2.4分離菌株同源性分析

將測序所得序列在NCBI數據庫中進行對比，然后再將對比結果相似度在98%以上的DNA序列下載下來，保存為fasta格式，用MEGA6軟件對fasta文件進行序列對比，最后制作成系統(tǒng)發(fā)育樹。根據菌株間的親緣關系確定所選菌株的種屬。

1.3　分離菌株產酸條件研究

1.3.1產酸曲線的測定

在無菌環(huán)境下用移液槍移取1 mL種子液到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，37 ℃下培養(yǎng)。分別在0，4，8，12，16，20，24，28，32 h下測定酸度(以乳酸計，電位滴定法[11])，計算并記錄數據。以上述時間作為橫坐標、產酸量作為縱坐標，繪制得到分離菌株的產酸曲線，以確定后續(xù)試驗中測定酸度的培養(yǎng)時間。

1.3.2發(fā)酵初始pH對分離菌株產酸能力的影響

接種 1 mL 種子液于初始 pH 分別為 3.5，5.0，6.5，8.0，9.5的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，140 r/min條件下培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對照，測定總酸，確定最適發(fā)酵初始pH。

1.3.3溫度對分離菌株產酸能力的影響

接種1 mL種子液于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中。分別于31，34，37，40，43 ℃，自然pH下140 r/min培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對照，測定總酸，確定最適溫度。

1.3.4轉速對分離菌株產酸能力的影響

接種1 mL種子液于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別于120，130，140，150，160 r/min，自然pH和最適溫度下培養(yǎng)28 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為空白對照，測定總酸，并確定最適轉速。

2　結果與分析

2.1　分離菌株鑒定

2.1.1分離菌株初篩

在MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入2%的碳酸鈣做產酸指示，通過澆注平板法培養(yǎng)，挑取透明圈較大的細菌進行劃線純化，最終篩選得到5株產酸細菌，分別編號B1，B2，B3，B4，B5。通過革蘭氏染色實驗，可知分離菌株均為革蘭氏陽性桿菌。

2.1.2分離菌株復篩

將初篩得到的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下靜止培養(yǎng)24 h，搖勻后取一定量的發(fā)酵液測定總酸，結果見圖1。

圖1　5株菌的產酸結果Fig.1 Acid-producing result of five strains

由圖1可知，菌株B2產酸量最高，因此選擇菌株B2做后續(xù)發(fā)酵試驗。

2.1.3分離菌株同源性分析

菌株DNA及PCR擴增電泳圖分別見圖2和圖3。

圖2　DNA電泳圖Fig.2 DNA electrophoretogram

圖3　PCR擴增產物電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of PCR amplified products

由圖2和圖3可知，菌株B2的DNA電泳圖存在一點拖尾的現象。

2.1.4分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將測序序列在NCBI數據庫中進行對比，然后再將對比結果相似度在98%以上的DNA序列下載下來，保存為fasta格式，用MEGA6軟件對fasta文件進行序列對比，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確分離菌株的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育地位，結果見圖4。

圖4　系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree

由圖4可知，分離菌株B2為鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。

2.2　分離菌株產酸條件研究

2.2.1分離菌株產酸曲線測定

分離菌株產酸曲線見圖5。

圖5　菌株的產酸曲線Fig.5 Acid-producing curve of strain

由圖5可知，該菌株在32 h的培養(yǎng)中，總酸呈上升趨勢，但在28 h后上升平緩，趨于穩(wěn)定。因此，在后續(xù)試驗中選擇培養(yǎng)28 h后測定總酸。

2.2.2發(fā)酵初始pH對分離菌株產酸的影響

pH對分離菌株產酸能力的影響見圖6。

圖6　pH對菌株產酸能力的影響Fig.4 Effect of pH value on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖6可知，當培養(yǎng)基初始pH為5.0時，該乳酸菌的產酸量最高，達到1.986 g/dL。當培養(yǎng)基初始pH<5.0時，乳酸菌的產酸能力下降，但不是很明顯；當pH在中性或者偏堿性的條件下時，該乳酸菌的產酸能力卻快速下降，這表明在酸性條件下可能有利于該菌的生長和發(fā)酵產酸。由此可知，因為在麩醋釀造過程中，環(huán)境pH基本上是偏酸性的，所以把該菌株用于釀造四川麩醋是可行的，具有依據的。

2.2.3溫度對分離菌株產酸的影響

溫度對分離菌株產酸能力的影響見圖7。

圖7　溫度對菌株產酸能力的影響Fig.7 Effect of temperature on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖7可知，溫度對于菌株的產酸能力影響較大，環(huán)境溫度從31～37 ℃時，分離菌株總酸呈上升趨勢，含量可達到1.725 g/dL；當溫度高于37 ℃時，菌株的產酸能力受到抑制，總酸下降到1.326 g/dL。這是因為溫度太高會影響菌株的生長，從而導致總酸含量下降。

2.2.4轉速對分離菌株產酸的影響

轉速對分離菌株產酸能力的影響見圖8。

圖8　轉速對菌株產酸能力的影響Fig.8 Effect of rotating speed on the acid-producing ability of bacteria strains

由圖8可知，當搖床轉速在140 r/min左右時，該菌株的產酸能力最強，總酸含量達到1.713 g/dL。當轉速低于140 r/min時，總酸含量降低，這是由于供氧量減少不利于該菌株的生長。因為乳酸菌是兼性厭氧型菌株，當轉速高于140 r/min時，供氧量增加會影響菌株發(fā)酵產酸，導致總酸含量下降，所以該菌株的最適搖床轉速為140 r/min。

3　結論

本試驗先從四川麩醋醋醅中篩選出

了5株產酸細菌，然后以產酸能力為指標進行復篩，選出產酸能力較強的菌株，并進行同源性分析，最終確定了該菌株為鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。并研究該菌株在不同發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉速下的產酸能力，結果表明該菌株的最佳產酸條件為初始pH5.0，溫度37℃，轉速140r/min，總酸含量1.986g/dL。

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