陳意標(biāo)，張漢雄，朱文標(biāo)，鄧國明

(1.梅州市人民醫(yī)院放療科，廣東 梅州 514031；2.梅州市人民醫(yī)院病理科，廣東 梅州 514031；3.梅州市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 梅州 514031)

Syrjanen[1]通過對食管鱗癌進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)40%的組織學(xué)形態(tài)改變與生殖道濕疣改變非常相似，具有人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染的特征性改變，從而第1次預(yù)測HPV可能是食管癌的致病因素。HPV感染被認(rèn)為是食管癌的重要易感因素之一，陸續(xù)有研究探討兩者關(guān)系，近年來世界不同地區(qū)用各種方法檢測了食管癌中HPV的陽性率，約為0%～67%，但在中國人群的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)研究結(jié)果中卻有著不同的結(jié)論[2]。本研究采用免疫組化方法檢測HPV在梅州地區(qū)客家人食管鱗癌組織和食管良性腫瘤組織中的表達(dá)，初步探討HPV與梅州地區(qū)客家人食管鱗癌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般資料查閱梅州市人民醫(yī)院1999年1月至2004年12月食管鱗癌患者的資料，選取其中61例食管鱗癌術(shù)后石蠟標(biāo)本，其中男49例，女12例；年齡39～76歲，中位年齡54歲。另外選取32例食管良性腫瘤石蠟標(biāo)本作為對照，其中男19例，女13例；年齡32～73歲，中位年齡45歲。入組標(biāo)準(zhǔn)為：梅州籍并在梅州長期(≥10 a)居??；術(shù)前未行放、化療；有明確病理診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：非梅州籍或雖為梅州籍但在梅州居住時(shí)間<10 a；術(shù)前曾行放、化療；無明確病理診斷。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑HPV16鼠源單克隆抗體購自美國BD公司，鼠抗兔IgG即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3檢測方法免疫組化檢測采用SABC法，抗原修復(fù)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法。具體步驟：1)脫蠟、水化：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后置于不銹鋼切片架上；2)封閉、修復(fù)：磷酸緩沖鹽溶液配置的新鮮體積分?jǐn)?shù)3% H2O2，室溫封閉8 min；蒸餾水洗3次，然后放入家用不銹鋼壓力鍋已經(jīng)煮沸的緩沖檸檬酸鹽緩沖液中(pH=6.0)?？凵蠅毫﹂y，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計(jì)時(shí)，90 s后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫。然后取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，之后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，每次3 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體；3)加一抗：滴加即用型一抗(即HPV16鼠源單克隆抗體)4 ℃孵育過夜；4)加二抗：磷酸緩沖鹽溶液洗5 min，重復(fù)3次，滴加鼠抗兔IgG抗體，室溫孵育30 min；5)滴加試劑SABC：磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次2 min。滴加SABC，室溫孵育30 min；6)顯色：磷酸鹽緩沖液洗4次，每次5 min，滴加DAB顯色劑，顯微鏡掌握顯色程度；7)蒸餾水洗1次，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，梯度脫水、透明、中性樹膠封片。試驗(yàn)均常規(guī)設(shè)置陰性對照(磷酸緩沖鹽溶液代替一抗)與陽性對照(陽性質(zhì)控標(biāo)本)。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn)HPV著色為棕黃色細(xì)小顆粒，分布在細(xì)胞漿內(nèi)。在低倍鏡下觀察切片著色情況，每張切片選取上下左右中5個(gè)視野，在高倍鏡(×400)視野下觀察陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度。每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，采用評分法評估HPV染色情況。陽性細(xì)胞百分率評分：0分，無細(xì)胞顯色或陽性細(xì)胞的百分率<5%；1分，5%～<35%細(xì)胞顯色；2分，35%～<65%細(xì)胞顯色；3分，≥65%細(xì)胞顯色。染色強(qiáng)度評分：0分，不顯色或微弱顯色；1分，輕度顯色，呈土黃色；2分，明顯顯色，呈棕黃色；3分，顯著顯色，呈深褐色。分別計(jì)算出每張切片每個(gè)視野的平均得分。最后將陽性細(xì)胞百分率得分與染色強(qiáng)度得分之和>1.0作為HPV染色陽性的標(biāo)準(zhǔn)。評估采用雙盲法由2名病理科醫(yī)生對免疫組化染色進(jìn)行評估。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1HPV在梅州地區(qū)客家人不同食管組織中的表達(dá)HPV全部著色在細(xì)胞漿，61例梅州地區(qū)客家人食管鱗癌組織標(biāo)本中HPV表達(dá)陽性24例(39.3%)，32例梅州地區(qū)客家人食管良性腫瘤組織中HPV表達(dá)陽性3例(9.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.150,P=0.005)。見圖1。

圖1 HPV在食管鱗癌(A)和

2.2HPV感染與梅州地區(qū)客家人食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系24例HPV感染的食管鱗癌患者中，中-高分化22例，低分化2例；而37例HPV陰性患者中，中-高分化4例，低分化33例，HPV感染患者的組織學(xué)程度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.916,P<0.001)。24例HPV感染的食管鱗癌患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例；而37例HPV陰性患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，HPV感染患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.649,P=0.031)。

3 討論

HPV是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8 000個(gè)堿基對，已發(fā)現(xiàn)180余種HPV亞型[3]。HPV病毒顆粒由DNA和蛋白質(zhì)組成，其核心為超螺旋雙鏈DNA，DNA長度為7 200～8 000 bp，所有開放讀碼框(open reading frame，ORF)均位于一條DNA鏈上，這條DNA鏈大致可分為3個(gè)基因區(qū)：早期蛋白編碼區(qū)、晚期蛋白編碼區(qū)及上游調(diào)控區(qū)。HPV基因產(chǎn)物分為早期蛋白和晚期蛋白，主要由2種啟動(dòng)子指導(dǎo)合成。早期啟動(dòng)子指導(dǎo)HPV早期蛋白的合成及ORF E6的上游表達(dá)，早期HPV蛋白包括E1、E2 、E4、E5、E6和E7，細(xì)胞的分化觸發(fā)晚期病毒的轉(zhuǎn)錄，從E7的ORF起始位點(diǎn)活化；晚期啟動(dòng)子調(diào)控晚期基因的表達(dá)，包括編碼衣殼蛋白的L1、L2、E4及E5，晚期轉(zhuǎn)錄的活化與上皮細(xì)胞的分化密切相關(guān)[4]。

HPV與許多部位上皮細(xì)胞惡性腫瘤有關(guān),最早確定的HPV相關(guān)腫瘤是宮頸癌。HPV感染與宮頸鱗癌的關(guān)系已經(jīng)得到深入研究[5-6]，其中HPV-16、HPV-18是人類宮頸癌的直接病因因素[7]，根據(jù)Brown等[8]的研究結(jié)果，HPV-16是宮頸鱗癌致瘤型HPV感染最常見的類型。

食管癌由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生，是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球腫瘤發(fā)病率中排第8位，死亡率中排第6位[9-10]。病理組織學(xué)上食管癌有鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌、腺棘皮癌等類型，食管鱗癌是食管癌最常見的組織學(xué)類型,占食管癌發(fā)病率的90%以上[11]。食管癌確切病因至今未明了，目前研究認(rèn)為是環(huán)境性致癌因素和遺傳因素長期作用的結(jié)果，已有調(diào)查資料顯示某些化學(xué)因素(如亞硝銨、霉菌毒素、吸煙、過度飲酒、濫用鴉片)、營養(yǎng)缺乏(如缺乏維生素A、B、C和微量元素)、物理因素(如熱食等)是食管癌發(fā)生的高危因素[9,12]。在歐美國家，食管癌發(fā)生率比較低，超過90%的食管鱗癌是與吸煙和酒精過量攝入有關(guān)[8]。然而，在食管鱗癌高發(fā)國家，如中國和伊朗，只有一小部分食管鱗癌是由吸煙和喝酒引起的[2,13]。因此，其他危險(xiǎn)因素可能是造成上述地區(qū)食管癌高發(fā)的原因，比如微生物，尤其是HPV，可能是其中的因素之一。HPV在食管癌發(fā)病中的作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的重視，關(guān)于HPV與食管癌關(guān)系的研究顯示在南非、日本和中國人群中食管癌變組織中可檢測到HPV的結(jié)構(gòu)蛋白[14-15]。Liyanage等[16]通過Meta分析在1 223例食管癌病例和1 445例對照病例中進(jìn)行了對比研究，結(jié)果表明HPV感染患者食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加3倍。Petrick等[17]在13 832例食管癌病例中對HPV與食管癌關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明HPV感染主要分布在亞非地區(qū)，尤其是中國食管癌高發(fā)區(qū)。

盡管大量研究[18-19]已表明HPV感染與食管癌密切相關(guān)，但不同地區(qū)HPV陽性率差異很大，在食管癌高發(fā)地區(qū)，HPV感染率顯著高于低發(fā)區(qū)。He等[20]檢測了中國食管癌高發(fā)區(qū)河南安陽的1 435例食管癌患者和2 071例健康對照血清中HPV水平，得出如下結(jié)論：HPV可能是河南安陽食管癌高發(fā)區(qū)導(dǎo)致食管癌發(fā)生的重要因素，其中HPV-16占主要地位。廣東潮汕地區(qū)是我國6大食管癌高發(fā)區(qū)之一，也是唯一的沿海食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌居當(dāng)?shù)馗鞣N惡性腫瘤死亡原因的第1位[21]。張東紅[22]在106例潮汕地區(qū)食管癌的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)食管癌組織中的HPV感染率為77.36%。梅州與潮汕地區(qū)相鄰，位于廣東省粵東地區(qū),是客家人的主要聚居地之一(95%以上為客家人),客家人由中原地區(qū)食管癌相對高發(fā)區(qū)遷移至梅州已有幾百年歷史,仍保持較高的食管癌發(fā)病率[23]。梅州客家人地區(qū)屬于華南地區(qū)食管癌相對高發(fā)區(qū)的范疇，發(fā)病率比不上相鄰的潮汕地區(qū)，關(guān)于梅州地區(qū)客家人食管鱗癌HPV感染情況的文獻(xiàn)報(bào)道也極少。

為探討以上問題，本研究查閱了梅州市人民醫(yī)院1999年至2003年的食管病變患者的資料，篩選出61例食管鱗癌術(shù)后石蠟標(biāo)本作為研究對象，32例食管良性腫瘤病變石蠟標(biāo)本作為對照，兩者均為梅州籍并在梅州長期(≥10 a)居住，應(yīng)用免疫組化方法檢測上述標(biāo)本中的HPV表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HPV全部著色在細(xì)胞漿，61例梅州地區(qū)客家人食管鱗癌組織標(biāo)本中HPV表達(dá)陽性24例(39.3%)，32例梅州地區(qū)客家人食管良性腫瘤組織中HPV表達(dá)陽性3例(9.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。梅州地區(qū)客家人食管鱗癌患者的HPV感染與其分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。這提示HPV在梅州地區(qū)客家人食管鱗癌組織中過量表達(dá)，HPV可能與梅州地區(qū)客家人食管鱗癌發(fā)生有關(guān)；同時(shí)，從臨床病理特征來看，HPV感染的食管鱗癌患者組織學(xué)程度較高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，提示預(yù)后較好。張東紅等[24]檢索1987年1月至2008年11月國內(nèi)外公開發(fā)表的有關(guān)我國人群食管癌和正常食管組織中HPV感染的文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為HPV在食管癌高低發(fā)區(qū)的感染情況不同，高發(fā)區(qū)為59.26%，低發(fā)區(qū)為34.66%。梅州客家人地區(qū)雖然位于華南地區(qū)食管癌的相對高發(fā)區(qū)，但與上述報(bào)道相比，本研究結(jié)果提示梅州地區(qū)客家人食管癌HPV的感染率接近文獻(xiàn)報(bào)道的低發(fā)區(qū)水平，具體原因尚不清楚。

綜上所述，HPV是食管癌的一個(gè)重要病因因素，HPV在食管癌中的高檢出率表明了HPV與食管癌發(fā)生的相關(guān)性，為食管癌流行病學(xué)、病因?qū)W研究和防治策略的制定提供了重要基礎(chǔ)。然而，HPV感染到致癌的過程非常復(fù)雜，HPV的致癌機(jī)制、HPV與其他致癌因素的協(xié)同作用以及HPV與機(jī)體之間的相互作用等尚未明確。本研究由于病例數(shù)不多，研究條件限制，結(jié)果仍需更大宗病例的前瞻性的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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