謝傳美，袁國華

（川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 風濕科，四川 南充 637000）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，目前從遺傳角度探索RA的發(fā)病機制成為研究熱點。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的小分子RNA，廣泛參與各種生理及病理過程[1-2]。miRNA可調(diào)節(jié)免疫應答，參與多種自身免疫病的發(fā)病[3-8]。miR-146、miR-155及 miR-233等與RA關(guān)系密切[9]。miR-146的單核苷酸多態(tài)位點（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2910164與自身免疫病相關(guān)[10-14]。miR-499a的rs3746444位點與RA相關(guān)[15-16]。中國人群miR-196a的rs11614913和miR-149的rs2292832位點與腫瘤及呼吸道疾病的易感性相關(guān)。本實驗探討以上位點與中國漢族人群RA患病風險的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選取2014年7月-2017年1月在川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕科住院的RA患者600例作為RA組，所有患者符合2009年美國風濕病學會和歐洲抗風濕聯(lián)盟的ACR-EULAR分類標準[17]。收集并統(tǒng)計RA患者臨床參數(shù)：年齡、性別、發(fā)病年齡、病程、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、DAS28評 分（disease activity score，DAS）、關(guān)節(jié)X射線分期、類風濕因子（rheumatoid factor，RF）滴度及抗環(huán)狀瓜氨酸抗體（anti-cyclic cirullonated peptide antibody，anti-CCP）滴度。隨機選取本院體檢中心健康體檢者398例作為對照組，對照組符合以下標準：①本人及其直系親屬無自身免疫疾病病史，且不符合RA診斷標準中的任意一項；②無嚴重疾病史；③近期1個月未使用激素和免疫抑制劑等藥物。本文中的研究對象均為無血緣關(guān)系漢族人。本研究獲得本院倫理委員會批準，實驗遵循赫爾辛基宣言，所有受試者自愿參加并簽署知情同意書。

1.2　全血細胞基因組DNA的提取與分型

所有研究對象抽取2 ml外周靜脈血置于EDTA抗凝管中，采用北京天根科技公司的Relax Gene Blood DNA系統(tǒng)提取所有樣本的基因組DNA。采用基于連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）的SNP分型技術(shù)（上海翼和應用生物技術(shù)有限公司）對所有樣本的4個SNP位點進行基因分型。簡要流程如下：①通過多重PCR技術(shù)獲得含有待檢測突變位點的基因片段；②通過多重LDR技術(shù)進行基因分型檢測；③最后通過測序儀電泳讀取檢測結(jié)果。

為確保實驗質(zhì)量，筆者在分型中使用雙重陽性對照（相同DNA樣本的重復）和陰性對照（空白，不含DNA樣本）。SNP和樣本分型正確率＞95%時方可進入下一步實驗流程。

1.3　統(tǒng)計學方法

使用SNPStats軟件分析基因分布是否符合哈迪-溫伯格平衡定律（hardy-weinberg equilibrium，HWE）。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，用t檢驗、方差分析或非參數(shù)檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗或Fishers確切概率法。本研究采用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）分析各變量間的組合并判讀較好的模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　兩組患者一般資料、等位基因及基因型頻率比較

RA組患者中男性134例，女性466例；平均年齡（41.4±5.9）歲；病程1.5～10.0年，平均4.0年。其中RF陽性、anti-CCP陽性、關(guān)節(jié)X射線分期＞Ⅱ期及DAS28評分＞3.2分者分別為70.5%、85.6%、47.2%和82.4%。平均ESR水平為23.8 mm/h（16.1～33.1 mm/h），平均CRP水平為7.8 mg/L（3.5～25.0 mg/L）。對照組患者中男性78例，女性320例；平均年齡（38.5±9.8）歲。兩組患者年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在本研究中，所有SNP位點的分型成功率均＞98%，4個位點均顯示出2個等位基因及3個基因型。對照組HWE檢驗顯示，符合HWE定律。兩組rs2910164、rs3746444、rs2292832及rs11614913等位基因和基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、2。

2.2　rs2910164、rs3746444、rs2292832 及rs11614913位點在不同遺傳模型下與RA比較

在不同遺傳模型下均未發(fā)現(xiàn)rs2910164、rs3746444、rs2292832及rs11614913與RA遺傳易感性相關(guān)（P＞0.05）。見表3～5。

2.3　CRP、ESR及DAS28評分與RA患者基因型頻率分布的關(guān)系

筆者采用CRP、ESR水平及DAS28評分評價RA的疾病活動度。通過比較4個位點不同基因型的CRP、ESR水平及DAS28評分，發(fā)現(xiàn)rs3746444位點與RA疾病活動性存在關(guān)聯(lián)，TT、TC及CC基因型的CRP水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步分析基因型間的CRP水平發(fā)現(xiàn)，TT基因型與TC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-3.365，P=0.001）；TT基因型與CC基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義；TC基因型與CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.098，P=0.036）。TT、TC及CC基因型的ESR水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），進一步分析基因型間的ESR水平發(fā)現(xiàn)，TT基因型與TC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.201，P=0.028）；TT基因型與CC基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TC基因型與CC基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。TT、TC及CC基因型的DAS28評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步分析基因型間的DAS28評分發(fā)現(xiàn)，TT基因型與TC基因型相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TT基因型與CC基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TC基因型與CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表6、圖1。

2.4　RA的疾病嚴重程度和基因型頻率分布的關(guān)系

筆者使用RF、CCP和X射線分別表示RA的疾病嚴重性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs3746444位點與RA的疾病嚴重性存在關(guān)聯(lián)，TT、TC和CC基因型的RF比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步研究發(fā)現(xiàn)TC基因型與TT＋CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RF陽性組的患病風險增加。TT、TC和CC基因型的anti-CCP比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步研究發(fā)現(xiàn)TC基因型與TT＋CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義陽性組的患病風險增加。同樣，TT、TC和CC基因型的X射線分期≤Ⅱ期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TC基因型與TT＋CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義[OlR=1.572（95%CI：1.084，2.279）P=0.017]，anti-CCP陽性組的患病風險增加。見表7～9。

表1　兩組患者基因型分布情況比較　例（%）

表2　各位點等位基因型的分布情況　例（%）

2.5　基因-基因相互作用和RA風險的廣義多因素降維模型分析

通過GMDR 0.9軟件進行多因子降維分析microRNA基因-基因交互作用與RA風險的相關(guān)性。列出3個不同組合的最佳模型，模型間訓練精確度、測試精確度及10次擬合的交叉驗證一致性（crossvalidation consistency，CV）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），未發(fā)現(xiàn)4個位點之間的交互作用與RA患病風險相關(guān)。見表10。

2.6　基因-性別相互作用和RA風險的廣義多因素降維模型分析

通過GMDR 0.9軟件進行多因子降維分析microRNA基因-性別交互作用與RA風險的相關(guān)性。列出4個不同組合的最佳模型，模型間的訓練精確度、測試精確度及10次擬合的CV比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。rs11614913-SEX構(gòu)成的組合符號訓練精準度、測試精準度及擬合的CV都較高，并且僅包含2個因子，符合簡約的原則。因此為最佳交互作用模型。見表11。

表3　顯性模型下SNP與RA的關(guān)系　例（%）

表4　隱性模型下SNP與RA的關(guān)系　例（%）

表5　超顯性模型下SNP與RA的關(guān)系　例（%）

表6　RA患者基因型頻率分布與CRP、ESR及DAS28評分的關(guān)系

圖1　RA患者CRP、ESR和DAS28評分與rs3746444基因型頻率分布的關(guān)系

表7　基因型頻率分布與RA組患者RF的關(guān)系　例（%）

表8　基因型頻率分布與RA組患者anti-CCP抗體的關(guān)系　例（%）

續(xù)表8

表9 基因型頻率分布與RA組患者X線分期的關(guān)系　例（%）

續(xù)表9

表10　基因-基因相互作用和RA風險的廣義多因素降維模型分析

表11　基因-性別相互作用和RA風險的廣義多因素降維模型

3　討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的、多種因素誘導的全身性自身免疫病，其中遺傳因素提供了個體發(fā)病的易感性。miRNA屬于表觀遺傳學的范疇，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了自身免疫病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。因此，基于miRNA基因改變能夠影響其表達及功能的設想，筆者選擇了中國人群中常見的SNP位點rs2910164、rs3746444、rs11614913及rs2292832探討和RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)。

在本研究中，筆者并未發(fā)現(xiàn)rs2910164、rs11614913及rs2292832和RA患病風險及疾病的活動性及嚴重性相關(guān)。人類miR-146a基因位于第5號染色體，許多研究顯示miR-146a在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要功能，特別是可以靶向抑制白細胞介素-1受體相關(guān)激酶、TNF受體相關(guān)因子6參與Toll樣受體/髓樣分化因子88（以下簡稱TLR/MyD88）信號通路的調(diào)控，進而影響核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）下游的白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥細胞因子的產(chǎn)生。許多研究提示，以上炎癥細胞因子可以誘導miR-146a在免疫細胞、滑膜成纖維細胞、滑膜組織中表達增加，或許和RA疾病的活動性相關(guān)[18-20]。rs2910164位點位于pre-miR-146a的負鏈序列，其突變可以導致pre-miR-146a發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖部由G∶U配對變成C∶U錯配，影響成熟miR-146a表達和功能，該位點多態(tài)性可能和miR-146a參與的疾病遺傳易感性有關(guān)[21]。然而，目前關(guān)于此位點與RA患病風險的結(jié)論報道不一。國內(nèi)外均有文獻報道，該位點的多態(tài)性與RA患病風險無關(guān)[15，22]。類似的，在本研究中，無論是從RA的患病風險，還是與RA的疾病活動性及嚴重性方面，均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。這些結(jié)果提示，rs2910164位點并不能影響miR-146a在TNF-α信號通路中的作用，miR-146a在RA中發(fā)揮作用的機制可能與該位點多態(tài)性無關(guān)。rs2292832位點位于miR-149的前體，它能負反饋調(diào)節(jié)TLR介導的免疫反應過程。有研究提示miR-149可能是TLR/MyD88信號通路的重要免疫調(diào)節(jié)因子，因為使用脂多糖刺激巨噬細胞系RAW264.7后，miR-149水平降低，而MyD88升高，TNF-α、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生亦減少[23]。miR-149在調(diào)節(jié)免疫反應中可能發(fā)揮了重要的作用，它能與MyD88的3’UTR直接結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負反饋調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生[24]。故有中國學者報道，基因型為CC的患者RA發(fā)病風險增大，即miR-149的rs2292832多態(tài)性位點與RA的遺傳易感性相關(guān)[25]。但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)該位點和RA易感性相關(guān)，出現(xiàn)此差異的可能性為前者研究樣本量較小，且和分型技術(shù)的靈敏度及準確度有關(guān)。因此，此位點是否在RA中發(fā)揮作用，還有待進一步考量。miR-196a的rs11614913位點涉及多種腫瘤的致癌過程。有研究顯示，該位點通過調(diào)控基因表達和調(diào)節(jié)促炎因子的產(chǎn)生，可以增加白塞病的發(fā)病風險[26]。然而，在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)該位點和RA發(fā)病相關(guān)。

位于MIR499A基因的rs3746444位點目前發(fā)現(xiàn)與RA、潰瘍性結(jié)腸炎及白塞病等多種自身免疫病相關(guān)[15-16，27]。值得注意的是，以上研究均發(fā)現(xiàn)CT基因型與疾病的相關(guān)性，提示超顯性遺傳模型在RA疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。類似的，在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)CT基因型與RA患者的臨床參數(shù)之間存在相關(guān)性。筆者發(fā)現(xiàn)CT基因型的患者的CRP、ESR水平及DAS28評分均較TT、CC基因型的升高，這與前人的研究結(jié)果相一致，可能提示miR-499a與RA疾病活動相關(guān)。眾所周知，RA是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病，可導致關(guān)節(jié)的畸形和毀損，因此在當今RA不能根治的情況下，治療中評價RA疾病活動度，并進行及時有效的治療對防止關(guān)節(jié)破壞，保護關(guān)節(jié)功能非常重要。國際上比較公認的評價RA疾病活動度的評分是DAS28，比較直觀簡便的方法是參考炎癥相關(guān)指標，如CRP、ESR及血小板等。最新研究表明，CRP檢測具有簡單、確定、重復性好及不受年齡干擾的特點，單獨測定CRP可能更適合評價疾病的活動性[28]。miR-499a的靶基因包括白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）受體B、IL-6以及其他細胞因子。IL-17是促炎癥細胞因子，可以誘導TNF-α、IL-1β、IL-6、白細胞介素-23及粒細胞集落刺激因子等細胞因子的合成，而IL-6可以通過肝臟刺激CRP和血纖維蛋白原的合成[29]。因此，筆者推測MiR-499a可以促進CRP的合成，從而導致炎癥的發(fā)展。

此外，在本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)rs3746444位點的CT基因型或許與RA疾病的嚴重性相關(guān)。其中RF陽性組和anti-CCP抗體陽性組的CT基因型頻率均較陰性組升高，并且在X射線分期嚴重骨破壞組（＞Ⅱ期）中也升高。目前研究表明RF具有預后意義，因為有高滴度類風濕因子者關(guān)節(jié)病變更嚴重、進展更快且更容易出現(xiàn)關(guān)節(jié)外病變。anti-CCP抗體的敏感性與免疫球蛋白M型類風濕因子相似，但anti-CCP抗體的特異性更高。檢測anti-CCP抗體有助于早期RA的鑒別診斷，而且對于確定那些有發(fā)生侵蝕性關(guān)節(jié)損害危險的早期RA患者也很有價值。這些都提示CT基因型的RA或許更容易進展為侵蝕性關(guān)節(jié)炎。有研究表明，miR-499a可以通過調(diào)節(jié)其靶基因PADI4的表達，從而對anti-CCP抗體的合成產(chǎn)生影響[22]。還有研究報道，IL-17誘導的一系列炎癥因子，例如TNF-α、IL-1β，可以促進破骨細胞的激活和分化，也可以通過激活NF-κB配體受體催化劑，從而在破骨細胞的生成中發(fā)揮作用，進一步導致骨質(zhì)的破壞和關(guān)節(jié)的炎癥[30]。因此，筆者推測miR-499a和侵蝕性RA存在一定的關(guān)聯(lián)。

前已述及，RA是由多因素誘導的復雜疾病，遺傳因素提供了個體發(fā)病的易感性，但卻不是疾病發(fā)生發(fā)展的唯一性因素。環(huán)境因素對RA的影響也較為顯著。因此，研究多個遺傳因素、環(huán)境因素，以及遺傳因素和環(huán)境因素間的交互作用對RA的影響顯得十分重要。

多因子降維分析法（Multifactor dimensionality，MDR）是一種非參數(shù)、無需遺傳模式的分析方法，它的主要特點是把高維的位點組合分成高危和低危2類，降低了數(shù)據(jù)的維數(shù)，并通過交叉驗證來檢驗模型。最后得到的結(jié)果是一組模型，每一個模型是從一個特定交互級別（l階、2階及交互作用）中選取最優(yōu)的。該方法不僅適用于病例對照的研究設計，而且可應用于復雜疾病的交互作用分析。以MDR方法為基礎，LOU等[31]學者發(fā)展了GMDR，與MDR相比較，GMDR采用基于廣義線性回歸的積分的統(tǒng)計方法，代替了MDR中的高危和低危分類，可處理計量和計數(shù)資料，同時允許調(diào)整協(xié)變量。這種方法和MDR丟失大量信息的降維方法不同，從而把握度也得到提高。本研究對上述4個基因的4個SNP位點用GMDR的方法進行了交互分析，結(jié)果顯示并未發(fā)現(xiàn)4個位點之間的交互作用與RA患病風險相關(guān)。然而，在基因-性別之間交互作用與RA風險的分析當中，結(jié)果顯示rs11614913-SEX構(gòu)成的組合符號檢驗有差異，且訓練精準度、測試精準度以及交叉一致性都較高，并且僅包含兩位點符合簡約的原則。因此為最佳交互作用模型，與RA發(fā)病有關(guān)，它們之間的調(diào)控機制可能參與了RA疾病的發(fā)展進程，然而這些推測都需要得到進一步的證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rs3746444（miRNA-499a）位點與中國漢族人群RA疾病的活動性和嚴重性相關(guān)，并且rs11614913位點（miR-196a）與性別之間存在交互作用，可能與RA發(fā)病有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)有待在更廣泛的樣本中得到證實。

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