張　浩 ，邵建國 ，卞兆連 ，張　玉

（1南京中醫(yī)藥大學，江蘇210023；2南京中醫(yī)藥大學附屬南通市第三人民醫(yī)院；3南通市肝病研究所）

原發(fā)性肝細胞肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內逐年上升，我國每年死于肝癌人數(shù)占全球50%[1]。目前肝癌患者的5年生存率不到10%，死亡率位于各大惡性腫瘤第3位[2]。導致原發(fā)性肝細胞肝癌的主要病因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、代謝型等多種因素，其中病毒性肝炎是最常見的因素。近年來，中醫(yī)藥治療肝癌已顯示一定的優(yōu)勢，并積累了豐富的臨床經(jīng)驗。下瘀血湯出自《金匱要略》，最初用于治療婦女產(chǎn)后瘀血內停致少腹疼痛。研究表明，下瘀血湯可干預實驗性肝硬化的形成，能抗肝纖維化、防治肝硬化[3]。全國名老中醫(yī)周岱翰教授[4-5]在運用下瘀血湯治療消化道腫瘤，尤其肝癌積累了豐富經(jīng)驗。本研究采用肝癌HepG2細胞體外實驗的方法，旨在進一步研究下瘀血湯對肝細胞肝癌的治療作用及其機制，為中醫(yī)藥治療肝細胞肝癌提供依據(jù)，報告如下。

1　材料與方法

1.1材料10只SD級大鼠，雌雄不拘，體重200±20g，實驗期間各組大鼠均飼養(yǎng)于南通大學實驗動物中心，自由飲水，進食大鼠基礎飼料。人肝癌細胞HepG2（南通市肝病研究所），DMEM高糖完全培養(yǎng)基（上海立菲生物有限公司），胎牛血清、胰蛋白酶Trypsin、0.25%EDTA（Invitrogen公司），磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾生物化學制品），CCK-8試劑盒（日本同仁化學）。細胞培養(yǎng)箱Thermo、超凈工作臺BIOBSE、RT-1510酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），流式細胞儀（美國BD FACSCalibur）。下瘀血湯：生大黃6g、桃仁6.7g、蟅蟲11.6g，由南通市中醫(yī)院中藥制劑室煎制，濃度為每mL含生藥量0.4g。

1.2方法

1.2.1大鼠含藥血清制備：SD級大鼠10只隨機分為對照組和服藥組，服藥組給藥劑量[6-9]為1mL/100g體重，每天灌胃2次，對照組給予相同劑量的滅菌注射用水，連續(xù)3天。最后一次灌胃2h后，以3%戊巴比妥麻醉大鼠，心臟取血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前?6℃水浴鍋滅活30min。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖：將HepG2細胞按3 000個/孔種植于96孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁后饑餓24h，加入不同濃度（0、10%、20%）含藥血清培養(yǎng)，按照CCK-8試劑盒說明書檢測各組細胞0h、24h、48h、72h時的 OD450值。

1.2.3凋亡實驗：將HepG2接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入不同濃度（0、10%、20%）含藥血清，培養(yǎng)48h，收集上清死細胞及貼壁細胞，根據(jù)試劑盒說明書依次向3組細胞中加入PE Annexin V和7-AAD試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4周期實驗：HepG2細胞經(jīng)各濃度含藥血清孵育72h后，收集于4℃預冷的70%乙醇，置入-20℃冰箱過夜處理。第2天加入染色劑（40×PI母液、100×RNase母液、1×PBS），上流式儀檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測NuSAP1表達：使用Trizol按照說明書步驟提取經(jīng)過不同濃度含藥血清處理72h的HepG2細胞的RNA，隨后用Y Applied Biosystems GeneAmp 9700 PCR 系統(tǒng)（37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，5 min）行逆轉錄，最后通過SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒行熒光定量PCR（CFX Connect Real-time System）檢測NuSAP1基因mRNA的表達量。通過Power=2-△△CT值計算相對表達量，隨后采用Power值行統(tǒng)計學分析。引物序列如下：β-actin:Forward 5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′；Reverse 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′；NuSAP1：Forward 5′-TCATTTCCTTTTCTTGCCTCA-3，Reverse5′-CCCTCAAGTACAGTGACCTGC-3′。

1.2.6Western-blot檢測 NuSAP 1表達：收集HepG2細胞，加入含cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液充分裂解后，離心取得蛋白。BCA法測定蛋白含量，以緩沖液將蛋白稀釋至濃度5～10 μg/μL。依據(jù)說明書配置分離膠、積層膠，凝固后上樣，80V恒定電壓下電泳30min，140V恒定電壓下電泳1h；制備夾層“三明治”，電壓100V，轉膜90min。麗春紅染液顯示蛋白條帶，將目的蛋白剪下，晾干備用。常溫下封閉液封閉膜2h后，加Nusap1抗體（Nusap1抗體6μL按1∶2 000雙蒸水配制12mL），置于4℃冰箱過夜。第2天再加入HRP標記的2抗（兔2抗3μL 加雙蒸水 12mL，1∶4 000），在暗室內化學發(fā)光、顯影、定影，膠片晾干。

1.3統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA統(tǒng)計方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1含藥血清抑制HepG2細胞增殖通過CCK-8實驗檢測含藥血清對HepG2細胞增殖的影響，結果顯示與對照組相比，不同濃度的含藥血清能夠明顯抑制HepG2細胞的增殖，這一抑制作用在加入含藥血清48h開始出現(xiàn)，72h更為明顯。我們發(fā)現(xiàn)在48h時，10%及20%含藥血清孵育的HepG2細胞與對照組比較，其OD值明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在72h時這一抑制作用更為明顯（P＜0.01）；同時含藥血清抑制HepG2細胞增殖具有濃度依賴性，表現(xiàn)為20%較10%含藥血清對HepG2細胞的抑制作用更明顯（P＜0.01）。見圖1。

圖1　下瘀血湯含藥血清抑制Hep-G2細胞增殖

2.2含藥血清對HepG2細胞周期的影響通過流式細胞技術檢測細胞周期，結果顯示與對照組比較，不同濃度的含藥血清對HepG2細胞周期起到阻滯作用，主要表現(xiàn)為將細胞阻滯于S及G2期。分別統(tǒng)計各組細胞的S期細胞所占比例，結果顯示10%含藥血清（P＜0.05）及 20%含藥血清（P＜0.01）組 S期細胞較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義；緊接著我們分析各組G2期細胞的比例，結果發(fā)現(xiàn)10%（P＜0.05）和 20%（P＜0.01）含藥血清組 G2期細胞比例較對照組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義。隨后我們分別統(tǒng)計各組細胞中處于S+G2期細胞所占比例，結果同樣顯示10%與20%含藥血清處于S+G2期細胞較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)20%含藥血清組將HepG2細胞阻滯于S+G2期的能力較10%含藥血清組更為明顯（P＜0.01），揭示含藥血清對細胞周期的阻滯作用具有濃度依賴性。見圖2，表1。

圖2　下瘀血湯含藥血清阻滯Hep-G2細胞周期流式圖

表1　下瘀血湯含藥血清阻滯Hep-G2細胞周期流式細胞儀檢測結果　%

2.3含藥血清對Hep-G2細胞凋亡的影響與對照組比較，10%和20%含藥血清對HepG2細胞系早期和晚期凋亡都有促進作用，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。我們還發(fā)現(xiàn)，20%含藥血清較10%含藥血清對HepG2細胞總體凋亡（早期+晚期）的促進作用更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3、表2。

圖3　下瘀血湯含藥血清促進Hep-G2細胞凋亡流式圖

2.4含藥血清抑制NuSAP1基因表達我們通過qRT-PCR檢測NuSAP1基因mRNA的表達情況，結果顯示，與對照組比較，10%和20%含藥血清組NuSAP1基因的mRNA表達較對照組比較明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同樣進一步分析發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象具有濃度依賴性，表現(xiàn)為20%含藥血清組NuSAP1基因mRNA表達水平較10%含藥血清組下降更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨后我們通過Western-blot檢測含藥血清對細胞表達NuSAP1蛋白的影響，結果顯示，10%和20%含藥血清均明顯抑制NuSAP1蛋白的表達（P＜0.05），且隨著含藥血清濃度的增加，抑制作用更為明顯（P＜0.05）。見圖 4，圖 5。

圖4　PCR檢測下瘀血湯含藥血清抑制NuSAP 1表達

圖5　Western-blot檢測下瘀血湯含藥血清抑制NuSAP1蛋白水平表達

3　討　論

核仁紡錘體相關蛋白1（NuSAP1）是一種微管結合蛋白，在紡錘體中發(fā)揮重要作用，是調控細胞周期的重要分子。該蛋白水平在細胞增殖過程中逐步上升，在G2/M期到達高峰，隨后出現(xiàn)下降，其過表達會致使細胞停滯在G1期，表達抑制則會導致紡錘體形成障礙，導致M期阻滯[10]，從而影響細胞增殖[11]。多項研究表明，NuSAP1基因在正常組織中幾乎不表達，而在多種腫瘤細胞中過表達，明顯高于非癌細胞[12-13]。抑制NuSAP1表達可以抑制肝癌的生長[14]。NuSAP1高表達與肝癌細胞的病理分化密切相關，并與肝癌的早期轉移有關[15]。

下瘀血湯組方簡單，大黃苦寒，性沉降，入血分，具有良好的活血逐瘀通經(jīng)的功效，既清瘀熱，又下淤血；桃仁味苦，善入心肝血分，善泄血滯，破血祛瘀力強；土鱉蟲歸肝經(jīng)，咸寒入血，性善走竄，能破血逐瘀消積。現(xiàn)代研究證實大黃的有效成分大黃素對多種腫瘤細胞，如肝癌、宮頸癌、腸癌細胞具有殺傷和抑制作用，抗腫瘤作用明顯[16-18]?，F(xiàn)代研究表明桃仁具有抗凝血、抗血栓、增強免疫力、抗腫瘤等作用[19]。藥理研究證實土鱉蟲具有抗移碼突變能力[20]，并能抑制人肝癌、胃癌細胞的呼吸[21]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，在含藥血清孵育48h后，顯示對肝癌細胞增殖的抑制作用，隨著孵育時間延長和濃度增加，抑制肝癌細胞增殖的作用更明顯，20%含藥血清孵育72小時較10%含藥血清具有更強抗腫瘤作用，其抑制作用與濃度、時間成一定的正比關系。含藥血清對細胞早期凋亡和晚期凋亡均有促進作用，含藥血清濃度越高促進凋亡的作用越明顯。細胞周期實驗顯示，高濃度含藥血清對肝癌細胞周期的抑制作用更明顯。提示應堅持臨床長期用藥，適當濃煎，適度增加服藥次數(shù)，以維持血液有效藥物濃度，可更好發(fā)揮下瘀血湯的抗腫瘤作用。PCR、Western-blot實驗結果顯示，下瘀血湯具有良好抑制NuSAP1表達的作用，其抑制作用與含藥血清濃度有關，20%含藥血清的抑制作用更加明顯。

綜上所述，下瘀血湯對肝癌細胞具有良好的抗增殖、促進凋亡、抑制細胞周期的作用，此作用可能與其抑制NuSAP1表達相關。在今后的實驗中，可進一步研究下瘀血湯抑制NuSAP1的信號通路以及與其他基因的關系。

[參考文獻]

[1]Bosch FX，Ribes J，Cléries R，et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis，2005，9（2）：191-211.

[2]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）:87-108.

[3]欽丹萍，蔣挺英，任永葆，等.下瘀血湯對實驗性肝硬化及其脂質過氧化反應干預研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（3）：25-27.

[4]周蓓，梁艷菊.周岱翰運用下瘀血湯辨治消化道腫瘤［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（12）：2338-2339.

[5]倪育淳，趙紅艷.周岱翰教授運用下瘀血湯加味治療肝癌的臨床經(jīng)驗介紹［J］.新中醫(yī)，2009，41（5）：8-10.

[6]柴可夫，李慧，樓基偉.下瘀血湯對慢性腎功能衰竭大鼠自由基影響的研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2002，9（3）：142-144.

[7]柴可夫，覃志成，李慧，等.下瘀血湯對糖尿病大鼠腎臟保護作用的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11（6）：344-345.

[8]陳洪宇，覃志成，王永鈞.加減下瘀血湯對脂質誘導小鼠腎小球足細胞增殖影響的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2006，13（6）：377-379.

[9]陳洪宇，童孟立，王永鈞，等.加減下瘀血湯對人腎小球系膜細胞清道夫受體表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2003，4（2）：67-70.

[10]Ribbeck K，Groen AC，Santarella R，et al.NuSAP，a mitotic RanGTP target that stabilizes and cross-links microtubules［J］.Mol Biol Cell，2006，17（6）：2646-2660.

[11]Beaudouin J，Gerlich D，Daigle N，et al.Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina［J］.Cell，2002，108（1）：83-96.

[12]Satow R，Shitashige M，Kanai Y，et al.Combined functional genome survey of therapeutic targets for hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2010，16（9）：2518-2528.

[13]謝萍，李璐，張令強，等.微管結合蛋白NuSAP的組織表達譜分析［J］.軍事醫(yī)學科學院院刊，2010，34（6）：509-512.

[14]Melstrom LG，Bentrem DJ，Salabat MR，et al.Overexpression of 5-lipoxygenase in colon polyps and cancer and the effect of 5-LOX inhibitors in vitro and in a murine model［J］.Clin Cancer Res，2008，14（20）：6525-6530.

[15]張猛，楊定華，劉蕭，等.Nusap1蛋白在肝癌中的表達及其臨床意義［J］.中南大學學報（醫(yī)學版），2013，38（9）：876-881.

[16]Thacker PC，Karunagaran D.Curcumin and emodin downregulate TGF-β signaling pathway in human cervical cancer cells［J］.PLoS ONE，2015，10（3）：e0120045.

[17]Pooja T，Karunagaran D.Emodin suppresses Wnt signaling in human colorectal cancer cells SW480 and SW620［J］.Eur J Pharmacol，2014，742：55-64.

[18]Hsu CM，Hsu YA，Tsai Y，et al.Emodin inhibits the growth of hepatoma cells：finding the common anti-cancer pathway using Huh7，Hep3B，and HepG2 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，392（4）：473-478.

[19]王仁芳，范令剛，高文遠，等.桃仁化學成分與藥理學活性研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（6）：426-429.

[20]陳永培，鄭鳴金，黃錦.臨床常用抗腫瘤中草藥的抗突變初步研究［J］.中國中藥雜志，1992，17（7）：431-432.

[21]唐先平，高鳳玲，王振卿.腫瘤臨床常用中藥指南［M］.北京：科學技術文獻出版社，2005.