袁強(qiáng)，王玉梅，殷實(shí)，姚軼俊，2，鞠興榮，王立峰，*

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

微膠囊技術(shù)是指將3種分散的自然形態(tài)的物質(zhì)包埋于連續(xù)薄膜中而形成微小包囊的一種技術(shù)，此技術(shù)在食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-3]。微膠囊既能包裹精細(xì)物質(zhì)，也能在需要時(shí)充分釋放。該技術(shù)除了可以改進(jìn)包埋物的物理特性，還可提高包埋物的穩(wěn)定性，保護(hù)包埋物免受外界因素的作用。微膠囊的直徑一般是1 μm～1 000 μm，其形態(tài)多是球形和不定形，壁材主要是惰性高分子材料[4]。食品工業(yè)中要求壁材不能與包埋物產(chǎn)生反應(yīng)，并且能夠滿足食品衛(wèi)生安全的要求[5-6]。在具體應(yīng)用中可用溶劑來(lái)激活使芯材得以釋放，并且準(zhǔn)確把握釋放的時(shí)間和部位，此優(yōu)點(diǎn)使該技術(shù)在醫(yī)藥等方面[7]被廣泛應(yīng)用。

研究表明，菜籽多肽具有降血壓活性[8]，抗氧化活性[9-11]，抗腫瘤活性[12]和抗血栓活性[13]等生物活性，因此菜籽多肽可以作為功能性食品和膳食補(bǔ)充劑。但由于菜籽多肽的環(huán)境穩(wěn)定性較差，在加熱及酸堿等條件下降解變性很快，生物活性受到嚴(yán)重影響，并且在人類食用狀態(tài)下會(huì)不可避免地受到胃腸系統(tǒng)的影響[14]。為了提高菜籽多肽的穩(wěn)定性，保存其特定的活性，就需要采取適當(dāng)措施。本試驗(yàn)就菜籽多肽的微膠囊包埋條件進(jìn)行探討，為后續(xù)的研究提供一定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

菜籽抗氧化肽：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院516實(shí)驗(yàn)室自制；β-環(huán)糊精和測(cè)蛋白含量試劑盒：索萊寶科技有限公司；熒光物質(zhì)（FL）、自由基產(chǎn)生劑ABAP、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox：Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q純水機(jī)：美國(guó)密理博公司；FreeZone 2.5L臺(tái)式冷凍干燥機(jī)：LABCONCO公司；SB 25-12 DTDN超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本HITACHI公司；Spectra－Max M2e酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3　方法

1.3.1　β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽的單因素試驗(yàn)

由預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果可知，影響β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽的主要因素包括壁芯比、超聲溫度、時(shí)間和功率，本試驗(yàn)就這4個(gè)因素對(duì)包埋率的作用進(jìn)行考察。芯壁比采用 2 ∶1、4 ∶1、8 ∶1、16 ∶1、32 ∶1，5 個(gè)水平；超聲時(shí)間采用 20、40、60、80、100 min 5 個(gè)水平；超聲溫度采用25、35、45、55、65 ℃ 5 個(gè)水平；超聲功率采用 40、55、70、85、100 W 5個(gè)水平。將β-環(huán)糊精配成15%的溶液后加入一定量的菜籽多肽，待多肽完全溶解后即放入超聲波清洗儀中，控制超聲的溫度、時(shí)間及功率，作用一定時(shí)間后冷凍干燥，再經(jīng)過(guò)研磨即可得到微膠囊化的產(chǎn)品。

1.3.2　β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽工藝的響應(yīng)面分析

在上述單因素分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用軟件Design-Expert設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定β-環(huán)糊精包埋的最佳工藝。

1.3.3　包埋率的測(cè)定

取一定量的制備好的菜籽多肽的微膠囊樣品，用水反復(fù)沖洗后放于水浴鍋中溶解，用試劑盒測(cè)定肽含量后按公式（1）計(jì)算包埋率：

1.3.4　微膠囊與原菜籽多肽的抗氧化能力指數(shù)（Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC）分析

稱取一定量的菜籽多肽的原樣品和含多肽量相同的微膠囊樣品，于室溫條件下放置10 d，每天于同一時(shí)間段測(cè)定ORAC值進(jìn)行比較。

參照文獻(xiàn)[15]的方法，并進(jìn)行一定的修改。將待測(cè)樣品溶解于75 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）中，質(zhì)量濃度為0.02mg/mL。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)孔中加入20 μL樣品溶液或各濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，再加入 200 μL 的熒光指示劑（0.96 μmol/L），在酶標(biāo)儀中溫育20 min后向各孔中迅速加入現(xiàn)配的20 μL偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2，2′-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride，ABAP）（119 mmol/L），用酶標(biāo)儀測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm；釋放波長(zhǎng)為520 nm；每隔5 min測(cè)一次）。ORAC值用Trolox當(dāng)量（μmol TE/g）表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　壁芯材的影響

壁芯比對(duì)包埋率的影響見(jiàn)圖1。

用β-環(huán)糊精對(duì)菜籽多肽進(jìn)行包埋時(shí)，設(shè)定超聲時(shí)間為60 min，溫度為45℃，功率為70 W，分析壁芯比分別為 2∶1、4∶1、8∶1、16∶1和 32∶1時(shí)對(duì)多肽包埋率的影響。圖1中表明壁芯比超過(guò)16∶1時(shí)，對(duì)于包埋率的影響趨于平緩，此時(shí)的包埋率為53.2%，所以在β-環(huán)糊精包埋處理時(shí)，壁芯比最佳值選用16∶1。

2.2　超聲時(shí)間的影響

超聲時(shí)間對(duì)包埋率的影響見(jiàn)圖2。

圖1　壁芯比對(duì)包埋率的影響Fig.1　The effects of the ratio of wall material and core material on embedding

圖2　超聲時(shí)間對(duì)包埋率的影響Fig.2　The effects of ultrasonic time on embedding rate

超聲時(shí)需要一定時(shí)間后樣品才能被包埋進(jìn)β-環(huán)糊精中，所以時(shí)間是非常重要的影響因素。在壁芯比為16∶1，超聲溫度為45℃，功率為70 W時(shí)，分析時(shí)間分別為20、40、60、80、100 min時(shí)包埋率的變化。圖2表明，超聲80 min后多肽的包埋率為73.36%。如果時(shí)間縮短就不能徹底包埋，包埋率較低，達(dá)不到很好包埋的效果，而時(shí)間太長(zhǎng)效果也不好，包埋率降低。綜合考慮，包埋最佳時(shí)間為80 min。

2.3　超聲溫度的影響

超聲溫度對(duì)包埋率的影響見(jiàn)圖3。

當(dāng)壁芯比為16∶1，時(shí)間為80 min，功率為70 W時(shí)，分析溫度為 25、35、45、55、65 ℃時(shí)對(duì)包埋率的影響。圖3中可知，一開(kāi)始溫度上升時(shí)包埋率也隨之上升，45℃時(shí)包埋率最大達(dá)到71.13%，之后溫度再上升時(shí)包埋率卻明顯減小，其原因可能是溫度太高時(shí)分子運(yùn)動(dòng)變劇烈，被包埋物又會(huì)從壁材中移出來(lái)。所以綜上所述，包埋的最佳溫度條件選為45℃。

2.4　超聲功率的影響

超聲功率對(duì)包埋的影響見(jiàn)圖4。

圖3　超聲溫度對(duì)包埋率的影響Fig.3　The effects of ultrasonic temperature on embedding rate

圖4　超聲功率對(duì)包埋的影響Fig.4　The effects of ultrasonic power on embedding rate

當(dāng)壁芯比為16∶1，超聲時(shí)間為80 min，溫度為45 ℃時(shí)，分析功率為 40、55、70、85、100 W 時(shí)對(duì)多肽包埋率的影響。圖4中超聲功率增加時(shí)，包埋率也隨之增加。功率達(dá)到70 W后包埋率的增加趨勢(shì)不明顯。綜合考慮，包埋功率確定為70 W。

2.5　響應(yīng)面法優(yōu)化包埋條件的結(jié)果分析

2.5.1　因素水平的選取及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，由于超聲功率受到實(shí)際條件的限制，試驗(yàn)僅將壁芯比、超聲溫度及時(shí)間這3個(gè)關(guān)鍵因素作為因變量，試驗(yàn)的因素水平和編碼見(jiàn)表1。利用Design-Expert軟件，三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1　試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1　Level and code of RSM

表2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)值Table 2　Arrangement and results of RSM

2.5.2　回歸方程的擬合及方差分析

由Design-Expert進(jìn)行回歸擬合后得到了包埋率（%）對(duì)各因素的擬合方程：

包埋率/%=74.78+1.13×A-1.18×B+1.78×-1.29×A×B+2.28×A×C+2.03×B×C-11.77×A2-3.22×B2-10.51×C2

表3顯示了模型中各因素的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，可以看出此模型極顯著（P＜0.000 1）。失擬值P=0.103 3（P＞0.05）不顯著，也就表明各處理值間有顯著差異，模型選擇較合理。校正決定系數(shù)R2adj是0.976 3，反應(yīng)了試驗(yàn)得到的回歸方程有效且擬合程度好，試驗(yàn)誤差小。B（P=0.047 4）、C（P=0.008 4）、AC（P=0.013 4）、BC（P=0.021 9）和B2（P=0.002 0）對(duì)包埋率影響顯著；A2（P＜0.000 1）和C2（P＜0.000 1）對(duì)包埋率影響極顯著，其余不顯著。

表3　方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 3　Analysis of variance and significance test of the equation

2.5.3　響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面圖形分析見(jiàn)圖5～圖7。

圖5　壁芯比與超聲時(shí)間對(duì)包埋率的影響交互三維曲面圖Fig.5　Three dimensional surface of the effects of wall core ratio and ultrasonic time on embedding rate

圖6　超聲時(shí)間和溫度對(duì)包埋率交互影響的三維曲面圖Fig.6　Three dimensional surface of the effects of ultrasonic time and temperature on embedding rate

圖7　壁芯比與超聲溫度對(duì)包埋率交互影響的三維曲面圖Fig.7　Three dimensional surface of the effects of wall core ratio and ultrasonic temperature on embedding rate

由圖5～圖7可以看出影響因子壁芯比、超聲時(shí)間和溫度對(duì)包埋率的都具有較明顯的影響。圖5中，隨著壁芯比的增加及超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋率呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明壁芯比和超聲時(shí)間對(duì)包埋率的增加有促進(jìn)作用；圖6中，增加超聲溫度能促進(jìn)包埋率的增加，而時(shí)間延長(zhǎng)到一定值后，時(shí)間的繼續(xù)增加則導(dǎo)致包埋率的降低；圖7中，隨著芯壁比及超聲溫度的增加，包埋率逐漸增加，但超聲溫度從45℃增加到55℃時(shí)，包埋率降低。

利用Optimization優(yōu)化功能，選擇響應(yīng)值為最大值，通過(guò)β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽包埋率的多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型的逆矩陣，最終得到最佳工藝參數(shù)為：壁芯比為20∶1，超聲時(shí)間為76.6 min，溫度為45.8℃，此條件是包埋率為74.99%。對(duì)應(yīng)實(shí)際情況將數(shù)據(jù)修正變?yōu)樾颈诓谋?0∶1，超聲時(shí)間76 min，溫度45℃，功率70 W，此情況的試驗(yàn)結(jié)果的包埋率是74.07%，與模型預(yù)測(cè)的理論值相差較小，所以所得的模型是可靠的。

2.6　抗氧化性（ORAC值）的比較

菜籽多肽原樣品與微膠囊后樣品的抗氧化性見(jiàn)圖8。

圖8　菜籽多肽原樣品與微膠囊后樣品的抗氧化性Fig.8　Comparation of antioxidation between microcapsulation and rapeseed peptides

由圖8可以看出，將多肽原樣品置于空氣中6天后ORAC值小于500 μmol TE/（g樣品），顯示了較低的抗氧化性；同時(shí)將經(jīng)過(guò)微膠囊化后的多肽樣品放置于空氣中10天均顯示了一定的抗氧化性，且抗氧化性的減小程度緩慢，ORAC值均大于600 μmol TE/（g樣品）。綜合比較可以看出將多肽樣品微膠囊后，其穩(wěn)定性在一定程度上有所增強(qiáng)。

3　結(jié)論

1）通過(guò)Design Expert軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合了β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽的包埋率的模型方程，此模型的顯著性檢驗(yàn)表明，壁芯比、超聲時(shí)間和溫度對(duì)包埋率都具有顯著的影響。

2）通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽的工藝參數(shù)，得到最優(yōu)條件：壁芯比為20∶1，超聲時(shí)間為76 min，溫度為45℃，功率為70 W，此時(shí)的包埋率達(dá)到74.07%，與模型預(yù)測(cè)的理論值相差不顯著，因此由響應(yīng)面法得到的β-環(huán)糊精包埋菜籽多肽的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳曉,王珺,霍乃蕊.微膠囊技術(shù)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工程,2011(1):3-6

[2]喬吉超,胡小玲,張團(tuán)紅,等.微膠囊技術(shù)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用[J].高分子通報(bào),2007(3):1-7

[3]洪柯江,滕斌,李宜.微膠囊技術(shù)及其在農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)機(jī)化學(xué)報(bào),2010(2):60-64

[4]梁治齊.微膠囊技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京,中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999[5]劉金文,孔繁東,劉兆芳,等.食品工業(yè)中微膠囊技術(shù)的應(yīng)用研究[J].中國(guó)食品添加劑,2014(6):148-151

[6]蔡茜彤,段小明,馮敘橋,等.微膠囊技術(shù)及其在食品添加劑中的應(yīng)用與展望[J].食品與機(jī)械,2014(4):247-251

[7]劉袖洞,于煒婷,王為,等.海藻酸鈉和殼聚糖聚電解質(zhì)微膠囊及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展,2008,20(1):126-139

[8]王立峰,金晶,袁建,等.液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE抑制肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(21):226-231

[9]He R,Ju X,Yuan J,et al.Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation[J].Food Research International,2012,49(1):432-438

[10]張晶,張怡一,徐斐然,等.菜籽多肽體外和細(xì)胞內(nèi)抗氧化性評(píng)價(jià)及氨基酸分析[J].食品科學(xué),2016,37(13):36-41

[11]王玉梅,張晶,謝慧慧,等.菜籽多肽穩(wěn)定性及RP-HPLC分離制備高抗氧化活性(ORAC)組分研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2015,21(5):36-39

[12]Wang L,Zhang J,Yuan Q,et al.Separation and purification of an anti-tumor peptide from rapeseed(Brassica campestris L.)and the effect on cell apoptosis[J].Food&Function,2016,7(5):2239-2248

[13]Zhang S B,Wang Z,Xu S Y.Antioxidant and Antithrombotic Activities of Rapeseed Peptides[J].Journal of the American Oil Chemists Society,2008,85(6):521-527

[14]王芳,田建文.微膠囊技術(shù)在食品抗氧化劑中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械,2010,26(4):149-152

[15]Wolfe K L,Kang X,He X,et al.Cellular Antioxidant Activity of Common Fruits[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2010,58(11):6621