張先瑞,方美云

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，遼寧 大連 116000；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 血液風(fēng)濕科，遼寧 大連 116001)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，以異常增殖的克隆性漿細(xì)胞為特征，骨痛、腎衰、貧血等是該病常見的臨床癥狀。隨著硼替佐米與來那度胺等新型藥物的應(yīng)用及自體造血干細(xì)胞移植治療的開展，MM患者的生存期明顯延長，但是該病的復(fù)發(fā)率仍將近100%[1]。越來越多的證據(jù)表明，MM中存在的能夠自我更新與不斷分化的腫瘤干細(xì)胞(MM stem cell,MMSC)與疾病的高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)，針對MMSC的靶向治療已成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)，但是MMSC的表型、起源及其作用機(jī)制目前仍不完全清楚。

MM細(xì)胞大多表達(dá)syndecan- 1(CD138)，CD138是一種對維持細(xì)胞形態(tài)及其與微環(huán)境相互作用等有著重要作用的細(xì)胞黏附分子。CD138抗原表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞增生、侵襲與耐藥有關(guān)[2]，MM細(xì)胞表面CD138低表達(dá)是疾病預(yù)后不良的重要指征[3]。有2%～5%的MM細(xì)胞不表達(dá)CD138[4]，既往研究認(rèn)為，CD138-MM細(xì)胞即為MMSC，但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，CD138+MM細(xì)胞也可以克隆源性生長，因此對于MMSC究竟是CD138+還是CD138-細(xì)胞目前尚存爭議。已知MMSC在具有低分化細(xì)胞表型、自我更新與分化能力、耐藥與高度侵襲能力同時(shí)兼具G1期阻滯及靜止表型等特征[5- 6]。作者通過歸納與分析CD138+與CD138-MM細(xì)胞相關(guān)生物特征的異同及兩者間的關(guān)聯(lián)以期進(jìn)一步探究MMSC的免疫表型、起源與調(diào)控機(jī)制。

1 CD138+與CD138-MM細(xì)胞生物特性的差異及機(jī)制

1.1 免疫表型與自我更新及分化能力

生發(fā)中心的B細(xì)胞受抗原刺激后可分化形成記憶性B細(xì)胞與漿細(xì)胞，不同分化階段的細(xì)胞具有特定的免疫表型。漿細(xì)胞為B細(xì)胞分化的終末細(xì)胞，B細(xì)胞特征性抗原的丟失使得漿細(xì)胞表面抗原呈異質(zhì)性，正常漿細(xì)胞與MM細(xì)胞表面抗原也有較大差異，CD38++CD138+CD19+CD45+CD56-/CD38++CD138+CD19-CD45-/+CD56+/-是用于區(qū)分良惡性漿細(xì)胞的主要免疫表型[2]。MM細(xì)胞間的免疫表型也存在很大的不同:首先是由MM疾病的異質(zhì)性決定的，主要表現(xiàn)在MM細(xì)胞膜抗原分子CD45、CD56、CD19的表達(dá)差異，近期發(fā)現(xiàn)有些MM患者還會(huì)表達(dá)特異性的抗原，如CD81、CD200、CD54等[2]；其次，由于MM疾病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過程，因此，MM細(xì)胞至少包括4個(gè)不同分化階段的細(xì)胞亞群，即記憶B細(xì)胞(CD19+CD27+/-CD138-CD38-)、漿母細(xì)胞(CD19+CD319+CD38++CD138-)、前漿細(xì)胞(CD19-CD319+CD38++CD138-)與漿細(xì)胞(CD19-CD319+CD38++CD138+)[7]。

不同免疫表型的MM細(xì)胞所具有的自我更新及分化能力不同。Matsui等[4]發(fā)現(xiàn)，從MM患者骨髓以及RPMI8226和NCI- H929細(xì)胞株中分離出的CD138-MM細(xì)胞在體外培養(yǎng)或接種于非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(non- obese diabetes/severe combinedimmunodeficient，NOD/SCID)體內(nèi)時(shí)，均可克隆生長并分化為MM漿細(xì)胞，而CD138+MM細(xì)胞卻不能夠長期增殖。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD19+CD20+CD27+CD138-記憶B細(xì)胞初次和再次植入NOD/SCID小鼠均可致瘤，且去除CD138-MM細(xì)胞中的CD20+細(xì)胞或CD27+細(xì)胞可分別抑制88%與83%腫瘤細(xì)胞的生長。因此，Matsui等[8]認(rèn)為，CD19+CD20+CD27+CD138-記憶B細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特征，能夠分化為MM漿細(xì)胞并可自我更新，進(jìn)而推測MMSC起源于記憶B細(xì)胞。

然而，近幾年研究得到了不同的結(jié)論。首先，DNA分析證實(shí)，CD38++CD19-細(xì)胞大多為非整倍體，其典型的細(xì)胞周期征象提示CD19-細(xì)胞群體中存在大量增殖狀態(tài)的細(xì)胞，而CD19+細(xì)胞為整倍體[9]；并且Chaidos等[7,10]將從MM患者骨髓及外周血中采集到的CD19+B細(xì)胞或漿母細(xì)胞注入NOD/SCID小鼠，結(jié)果均未能構(gòu)建MM模型。其次，Paíno等[11]發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞特征性抗原CD20僅在RPMI- 8266細(xì)胞株中極少量表達(dá)(0.3%)，且CD20dim+RPMI- 8266細(xì)胞基因表達(dá)序列并無Hedgehog、ABCG2等MMSC相關(guān)基因的表達(dá)，CD20dim+MM細(xì)胞自我更新能力甚至不及CD20-MM細(xì)胞，由此Paíno等認(rèn)為CD20也非MMSC的相關(guān)抗原。除此之外，若干體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明CD138+MM細(xì)胞也具有克隆源性[7，10，12]。從MM患者骨髓標(biāo)本中分離的CD138+漿細(xì)胞注入NOD/SCID小鼠后可引起MM的表現(xiàn)，并能成功植入第2只小鼠，只是CD138+MM細(xì)胞克隆生長速度較CD138-細(xì)胞緩慢[9- 10]?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，目前研究者們更傾向于MMSC起源于漿細(xì)胞這一觀點(diǎn)。CD138+漿細(xì)胞可能由于基因突變失去成熟表型而形成CD138-MMSC[9]；Chaidos等[7]推測MMSC可能是CD19-CD138-前漿細(xì)胞；鑒于CD138+MM細(xì)胞克隆生長的表現(xiàn)，也有研究者認(rèn)為MMSC是CD19-CD38+CD138+漿細(xì)胞[12]。CD138+與CD138-漿細(xì)胞在MM腫瘤起始中的作用及細(xì)胞內(nèi)分子與基因的變化尚需更多研究。

在新近發(fā)表的文獻(xiàn)中，Johnsen等[12]通過分析CD19+CD27+CD38-單細(xì)胞cDNA文庫后提出了“多步驟癌變”理論：惡變起始于克隆型記憶B細(xì)胞，MMSC的出現(xiàn)經(jīng)歷了一系列分子與基因的改變?；蛲蛔冊贛M的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，在選擇壓力下出現(xiàn)的“驅(qū)動(dòng)型突變”即可導(dǎo)致MMSC的出現(xiàn)，Johnsen等[12]由此推測MM中可能同時(shí)存在不同表型的MMSC。

1.2 侵襲能力

MM具有高度侵襲性，常累及肋骨、椎骨、股骨近端及骨盆等處，超過70%的MM患者體內(nèi)有循環(huán)的惡性漿細(xì)胞[13]。MM細(xì)胞本身即具有侵犯血管、進(jìn)入骨髓及系統(tǒng)循環(huán)的能力，Chen等[13]在細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CD138-MM細(xì)胞穿到Transwell小室下的數(shù)量是CD138+MM細(xì)胞的2倍，證明CD138-細(xì)胞侵襲與遷移能力更強(qiáng)。通過進(jìn)一步研究，他們認(rèn)為這與CD138-MM細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)的SH3GL3有關(guān)。SH3GL3通過磷酸化黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)活化細(xì)胞內(nèi)FAK/PI3K、FAK/Src/RhoA/ROCK與FAK/p38信號通路，促進(jìn)了CD138-MM細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

MM細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的相互作用也對細(xì)胞轉(zhuǎn)移起著重要作用。骨髓中的內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)可通過黏附及促血管新生等促進(jìn)MM細(xì)胞的遷移，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)分泌的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF- 1)可形成化學(xué)因子濃度梯度誘導(dǎo)MM細(xì)胞歸巢[14]。同時(shí)，MM細(xì)胞也可以通過分泌細(xì)胞因子或化學(xué)因子來調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境以促進(jìn)自身的轉(zhuǎn)移。Wu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CD138-細(xì)胞也可以分泌SDF- 1，作用于BMSC表面的SDF- 1受體(CXCR4)從而提高BMSC的細(xì)胞僵化程度，而CD138+細(xì)胞卻無此調(diào)節(jié)功能。已知腫瘤細(xì)胞在僵化的微環(huán)境中增殖與遷移力增強(qiáng)[16]，這可能是CD138-細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲力與遷移力的另一機(jī)制。

1.3 靜息狀態(tài)

在許多達(dá)到完全緩解臨床標(biāo)準(zhǔn)的患者體內(nèi)仍可檢測到循環(huán)或殘留的腫瘤細(xì)胞，這與腫瘤干細(xì)胞的休眠機(jī)制密切相關(guān)。處于細(xì)胞靜止期的腫瘤干細(xì)胞對化療藥物不敏感，且可以逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視得以長期存活，在適當(dāng)?shù)拇碳は驴梢灾匦逻M(jìn)入細(xì)胞分裂周期并導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。Muz等[6]觀察到在低氧環(huán)境下CD138抗原表達(dá)減少的MM細(xì)胞更具干細(xì)胞樣特征，并且出現(xiàn)G1期阻滯與DNA合成減少的現(xiàn)象。研究者們推測CD138-MM細(xì)胞中處于靜止期的細(xì)胞數(shù)量多于CD138+細(xì)胞[7- 8]，但是對這一觀點(diǎn)目前有爭議。

Matsui等[8]發(fā)現(xiàn)，幾乎所有RPMI- 8226與NCI- H929細(xì)胞中的CD138-細(xì)胞(>98%)均處于G0～G1期，而僅有72%或77%的CD138+MM細(xì)胞處于靜止期。Chaidos等[7]也觀察到MM患者骨髓樣本中處于S期的CD138-前漿細(xì)胞數(shù)量明顯少于CD138+漿細(xì)胞。然而，Paíno等[5]卻提出了相反的觀點(diǎn)，他們用Ki- 67對從RPMI- 8226及NCI- H929細(xì)胞中分離出的CD138++與CD138low細(xì)胞染色，結(jié)果顯示這兩種不同表型的細(xì)胞群中均有25%以上的細(xì)胞處于S期或G2～M期，且處于分裂期的CD138low細(xì)胞與CD138++細(xì)胞的數(shù)量并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Lawson等[17]指出，89%處于靜止期的5TGM1骨髓瘤細(xì)胞都是CD138+細(xì)胞，Reid等[18]甚至發(fā)現(xiàn)CD38++CD138-細(xì)胞的增殖速率比CD38++CD138+細(xì)胞更快。以上不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與MM細(xì)胞株種類、細(xì)胞培養(yǎng)方式及環(huán)境的差異有關(guān)。

近期，Yaccoby[1]提出靜止性MMSC與增殖性MMSC同時(shí)存在，并可在微環(huán)境與基因突變、表觀遺傳調(diào)節(jié)影響下相互轉(zhuǎn)換這一觀點(diǎn)。成骨細(xì)胞可維持MM細(xì)胞處于靜止期，而破骨細(xì)胞則可誘導(dǎo)靜息狀態(tài)的MM細(xì)胞分裂增殖[17]，細(xì)胞狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)換使得CD138-或CD138+細(xì)胞群體中同時(shí)存在處于靜止與增殖期的細(xì)胞。

1.4 藥物敏感性

耐藥是導(dǎo)致MM高復(fù)發(fā)率與不可根治的主要原因之一，MM的耐藥機(jī)制包括:(1) 細(xì)胞分子遺傳學(xué)的改變：含ATP結(jié)合區(qū)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP- binding cassette transporters,ABCT)表達(dá)升高，細(xì)胞藥物外排作用增加；對乙醛毒性物質(zhì)及活性氧自由基具有降解作用的乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性升高；抗凋亡基因與自噬相關(guān)基因表達(dá)增加等[15- 16]。(2) 骨髓微環(huán)境介導(dǎo)耐藥：MM患者骨髓微環(huán)境可通過細(xì)胞黏附與分泌細(xì)胞因子等途徑支持MM細(xì)胞存活與增殖，并能幫助抵抗化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

不同表型的MM細(xì)胞對藥物敏感性不同，多數(shù)研究者認(rèn)為CD138-細(xì)胞比CD138+細(xì)胞耐藥性更強(qiáng)[3，7，19]。Kawano等[3]回顧性分析了90例初診MM患者與15例復(fù)發(fā)MM患者的漿細(xì)胞表面CD138抗原表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)患者CD138-細(xì)胞明顯增多(29.8%vs.6.6%，P<0.05)。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從同一患者標(biāo)本中分離出的低表達(dá)CD138的KYMM- 1細(xì)胞系對來那度胺敏感性較高表達(dá)CD138的KYMM- 2細(xì)胞系低，且從KYMM- 2中分離出的CD138-細(xì)胞也比CD138+細(xì)胞更具來那度胺抵抗性。Chaidos等[10]也發(fā)現(xiàn)CD138-前漿細(xì)胞耐藥性是CD138+漿細(xì)胞的300多倍。Franqui- Machin等[20]認(rèn)為這可能與CD138-細(xì)胞內(nèi)的Hedgehog(Hh)信號通路激活有關(guān)。與CD138+MM細(xì)胞相比，CD138-細(xì)胞內(nèi)SMO和GLi表達(dá)增強(qiáng)，而PTCH幾乎不表達(dá)，提示CD138-MM細(xì)胞對Hh配體更為敏感，而活化的Hh信號通路可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2的表達(dá)以增強(qiáng)細(xì)胞耐藥性[20]。CD138-MM細(xì)胞內(nèi)的Hh信號通路受視黃酸受體- α2(retinoic acid receptor alpha2，RARα2)的調(diào)控[21]。RARα2在復(fù)發(fā)的MM患者骨髓中表達(dá)升高，在CD138-MM細(xì)胞中的表達(dá)水平也明顯高于CD138+MM細(xì)胞。Yang等[21]的研究顯示，RARα2不僅可以增強(qiáng)MM細(xì)胞ALDH的活性，還能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因Bcl- 2、Bcl- xl與Mcl- 1的表達(dá)以減少化療藥物誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡，針對RARα2的靶向治療有可能逆轉(zhuǎn)患者對治療藥物的抵抗。

骨髓微環(huán)境與MM耐藥密切相關(guān)。既往研究[22]報(bào)道,骨髓龕位(niche)的細(xì)胞成分可分泌IL- 6與骨保護(hù)素等細(xì)胞因子促進(jìn)MM細(xì)胞增殖并抑制凋亡。MM細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的整合素VLA- 4與龕位黏附以活化細(xì)胞中NF- κB信號通路從而介導(dǎo)細(xì)胞耐藥。CD138+和CD138-MM細(xì)胞耐藥性的差異是否與骨髓微環(huán)境有關(guān)目前尚無報(bào)道。已知VLA- 4在抵抗性漿細(xì)胞中高表達(dá)，筆者推測可能CD138-MM細(xì)胞表面整合素VLA- 4的表達(dá)較CD138+MM多，因此與骨髓龕位黏附作用更強(qiáng)。推論尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

2 CD138+與CD138-MM細(xì)胞間的關(guān)系

目前，研究者們大多認(rèn)為具有成熟表型與不成熟表型的MM細(xì)胞亞群處于可相互轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)平衡之中[1]。Wen等[23]將從初診的MM患者骨髓樣本中分離純化的CD138-或CD138dim的側(cè)群細(xì)胞(side population cell, SP)與CD138+的非側(cè)群細(xì)胞(non- side population cell, NSP)細(xì)胞培養(yǎng)5個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)細(xì)胞系并無明顯區(qū)別，并且NSP細(xì)胞去分化得到的SP細(xì)胞仍具有MM干細(xì)胞的特征，Wen等[23]由此推測不僅CD138-MMSC可以分化成為CD138+細(xì)胞，CD138+MM細(xì)胞也可以去分化形成CD138-細(xì)胞。Chaidos等[7]也發(fā)現(xiàn)CD19-CD138-前漿細(xì)胞與CD19-CD138+漿細(xì)胞之間的相互轉(zhuǎn)換。

為探究CD138+細(xì)胞與CD138-細(xì)胞相互轉(zhuǎn)換的發(fā)生機(jī)制，Chaidos等[7]對這兩種細(xì)胞進(jìn)行基因測序分析，發(fā)現(xiàn)了一些表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，如SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物、Polycomb抑制型復(fù)合物的成分在CD138-細(xì)胞中表達(dá)增加，推測CD138+細(xì)胞與CD138-細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換可能受表觀遺傳調(diào)節(jié)控制。同時(shí)CD138mRNA在CD138+與CD138-細(xì)胞中并無區(qū)別，CD138抗原表達(dá)的差異可能受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用影響。Christensen等[24]發(fā)現(xiàn)，CD138+MM細(xì)胞凋亡時(shí)由于蛋白酶裂解作用或蛋白生成減少，CD138抗原丟失形成CD138-細(xì)胞。

根據(jù)CD138+細(xì)胞與CD138-細(xì)胞在小鼠模型體內(nèi)的分布差異[10]以及MM細(xì)胞與鄰近細(xì)胞的密切關(guān)系，研究者們推測，CD138+細(xì)胞與CD138-細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)換還受骨髓微環(huán)境影響。Fuhler等[25]發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞與BMSC共同培養(yǎng)后CD138-細(xì)胞含量增多，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可通過分泌IL- 6及黏附作用促使MM細(xì)胞向低分化表型細(xì)胞轉(zhuǎn)換，而間充質(zhì)干細(xì)胞也可通過黏附作用降低CD138抗原的表達(dá)。Wen等[23]報(bào)道低氧環(huán)境下SP細(xì)胞比例增加，通過阻斷TGF- β1通路可有效抑制低氧誘導(dǎo)的NSP細(xì)胞去分化。關(guān)于CD138-與CD138+細(xì)胞間相互轉(zhuǎn)換機(jī)制尚需更多的研究，針對表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的治療及誘導(dǎo)具有不成熟表型的MM細(xì)胞分化為MM的治療提供了新的思路。

3 總結(jié)及展望

明確MMSC的免疫表型對于推動(dòng)MM治愈方案的研究有著重要意義，一方面有利于MMSC的分離純化以便于更深入地研究MMSC形態(tài)功能與作用機(jī)制，另一方面有利于MMSC靶向治療的發(fā)展。目前研究者們大多認(rèn)同MMSC源于漿細(xì)胞而非記憶性B細(xì)胞這一觀點(diǎn)，但對CD138-與CD138+漿細(xì)胞在腫瘤起始中的作用仍存在爭議。CD138+與CD138-細(xì)胞間共有291種基因差異表達(dá)，因而兩者的免疫表型及生物特征差異較大[15]。我們通過分析相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，與CD138+MM細(xì)胞相比，CD138-MM細(xì)胞更具干細(xì)胞樣特征。盡管在細(xì)胞自我更新能力與靜息狀態(tài)方面仍有爭議，但是CD138-細(xì)胞表型低分化且表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性與侵襲力。多項(xiàng)研究還顯示，CD138+與CD138-MM細(xì)胞能夠相互轉(zhuǎn)換，因此臨床中針對CD138+MM細(xì)胞的單藥治療并不能取得預(yù)期的治療效果[7]，誘導(dǎo)分化聯(lián)合CD138-MM細(xì)胞靶向治療可能是未來治療MM的方向。CD138-MM細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制與克隆源性骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型仍需進(jìn)一步研究。