李脈超，安普天，崔曉娟，朱文文，孟敏，張益萌，金利新

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，山東青島 266001；2青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系)

背根損傷是周?chē)窠?jīng)損傷的一種，損傷導(dǎo)致的部分感覺(jué)缺失可引起患者一系列的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)損傷癥狀。脊神經(jīng)背根損傷后，脊髓膠質(zhì)反應(yīng)增強(qiáng)，脊髓后角神經(jīng)元凋亡丟失，相應(yīng)脊髓節(jié)段神經(jīng)元失去了感覺(jué)信息傳入，從而引起患側(cè)感覺(jué)缺失和異常，嚴(yán)重影響患者生活和工作[1,2]。目前，臨床上對(duì)于脊神經(jīng)背根損傷的治療大多處于實(shí)驗(yàn)階段，如自體神經(jīng)移植術(shù)及利用雪旺細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)促進(jìn)功能恢復(fù)[3,4]，但這些治療方法有一定的局限性[5]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是一種可以提高神經(jīng)健康水平和促進(jìn)功能恢復(fù)的輔助治療方式，近年受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[6,7]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練已廣泛應(yīng)用到諸如腦卒中、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)損傷等神經(jīng)疾病康復(fù)領(lǐng)域，并取得的良好的效果。但目前運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于各種原因引起的背根損傷的應(yīng)用效果仍是未知。本研究觀(guān)察了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)脊神經(jīng)背根損傷大鼠痛覺(jué)功能的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量230～250 g，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，濕度55%±15%；自由飲食，給予充足的飼料和水，12 h光照交替。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理要求。

1.2 主要試劑及儀器膠原纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、離子鈣接頭分子(Iba-1)單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，二步法超敏試劑盒(中杉金橋公司)；ZH-PT型動(dòng)物跑臺(tái)(淮北正華生物儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、脊神經(jīng)背根損傷模型制備及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方法所有大鼠隨機(jī)分為3組各15只。訓(xùn)練組及手術(shù)組均采用脊神經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)切除術(shù)制備脊神經(jīng)背根損傷模型：將大鼠俯臥于手術(shù)臺(tái)上，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，常規(guī)備皮消毒。找到L4腰椎，沿后正中線(xiàn)偏右依次切開(kāi)右側(cè)背部皮膚及皮下筋膜，分離棘突旁肌肉，顯現(xiàn)椎間孔，用咬骨鉗咬除L4椎體上下的關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)以擴(kuò)大手術(shù)野。分離顯示背根神經(jīng)節(jié)，依次切斷并取出右側(cè)L3、L4脊神經(jīng)節(jié)，斷端間距2 mm。逐層消毒縫合切口。假手術(shù)組不制備模型，僅咬除相應(yīng)關(guān)節(jié)突，分離至觀(guān)察到脊神經(jīng)，不損傷脊神經(jīng)。制模后每天肌肉注射青霉素4 萬(wàn)U/只，連續(xù)注射3 d，預(yù)防感染。正常飲食，自然光照。訓(xùn)練組于制模后7 d開(kāi)始跑步訓(xùn)練，大鼠在ZH-PT型動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行平板運(yùn)動(dòng)，速度為15 m/min，每隔5 min休息30 s，持續(xù)30 min，1次/d，共28 d。手術(shù)組與假手術(shù)組不進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，自由活動(dòng)。

1.4 大鼠痛覺(jué)閾值測(cè)定 采用北京拜安吉科技有限公司電子測(cè)痛儀Electric von-frey測(cè)定各組大鼠制模前1 d及制模1、7、14、21、28 d的痛覺(jué)閾值。將剛性測(cè)試頭安裝在探頭上，在大鼠脛骨中點(diǎn)處施加壓力，如果大鼠出現(xiàn)快速縮足或鳴叫，即為一次陽(yáng)性反應(yīng)，此時(shí)讀出電子控制器上的數(shù)值即為痛覺(jué)閾值。每只大鼠測(cè)量5次，每次測(cè)量間隔時(shí)間為10 min，去除最大值、最小值，取平均值。

1.5 大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1檢測(cè)于制模7、14、28 d各組分別取5只大鼠，用4 ℃生理鹽水200 mL及4%多聚甲醛300 mL進(jìn)行心臟灌注，然后取出L3、L4節(jié)段脊髓，放入4%多聚甲醛液中固定，3 d后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片，切片厚度3 μm。一抗為GFAP單克隆抗體和Iba-1單克隆抗體，使用二步法超敏試劑盒做兩步法染色，DAB顯色，中性樹(shù)膠封片。在200倍顯微鏡下對(duì)患側(cè)脊髓后角拍照，拍照時(shí)設(shè)定相關(guān)拍攝參數(shù)，保證圖像獲取的一致性。使用Image-pro plus6.0軟件勾畫(huà)出脊髓后角Ⅱ板層，并將此區(qū)域設(shè)為AOI，獲取脊髓后角Ⅱ板層的OD值。

2　結(jié)果

2.1制模前后各組大鼠痛覺(jué)閾值比較見(jiàn)表1。

表1　制模前后各組大鼠痛覺(jué)閾值比較

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與同組制模前1 d比較，#P<0.05。

2.2各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP OD值比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　　　　各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層GFAP OD值比較

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與同組制模7 d比較，#P<0.05。

2.3各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層Iba-1 OD值比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　　　　各組大鼠脊髓后角Ⅱ板層Iba-1 OD值比較

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與同組制模7 d比較，#P<0.05。

3　 討論

脊神經(jīng)背根損傷多是由于車(chē)禍、手術(shù)、分娩等損傷后引起神經(jīng)根受到牽拉，或出現(xiàn)脊柱損傷、骨折，從而使神經(jīng)根受壓甚至出現(xiàn)神經(jīng)根斷裂等原因所導(dǎo)致。脊神經(jīng)背根損傷臨床上常表現(xiàn)為患者感覺(jué)異常或喪失、患側(cè)肢體無(wú)力等癥狀，甚至?xí)霈F(xiàn)病理性神經(jīng)疼痛，嚴(yán)重影響患者的感覺(jué)功能、運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量。臨床常用的治療方式是通過(guò)手術(shù)對(duì)斷開(kāi)的神經(jīng)進(jìn)行縫合，或應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物輔助治療[8]，但治療效果并不理想。如何促進(jìn)感覺(jué)功能的恢復(fù)是目前研究的熱點(diǎn)。

神經(jīng)損傷康復(fù)是建立在神經(jīng)可塑性和功能重組的理論基礎(chǔ)上的。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為一種康復(fù)方式，正是利用神經(jīng)細(xì)胞所具有的可塑性，進(jìn)行不斷重復(fù)再學(xué)習(xí)的功能訓(xùn)練，從而實(shí)現(xiàn)一定的功能恢復(fù)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子尤其是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等增加[9]，可以在一定程度上促進(jìn)中樞神經(jīng)的功能重塑。因此，運(yùn)動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的康復(fù)過(guò)程中。

痛覺(jué)作為感覺(jué)的一種類(lèi)型，可以在一定程度上反映感覺(jué)系統(tǒng)的恢復(fù)程度。本文結(jié)果顯示，脊神經(jīng)背根損傷斷后，手術(shù)組和訓(xùn)練組痛覺(jué)閾值升高，之后隨時(shí)間推移逐漸降低，反映機(jī)體痛覺(jué)存在一定代償機(jī)制。即當(dāng)某一節(jié)段的神經(jīng)節(jié)切除后，被切除神經(jīng)節(jié)所支配區(qū)域的皮膚仍然存在一定的感覺(jué)，這是由于此重疊神經(jīng)支配區(qū)域的其中一部分神經(jīng)節(jié)的軸突失去作用時(shí)，與之相競(jìng)爭(zhēng)的相鄰神經(jīng)的背根神經(jīng)節(jié)起到維持該區(qū)域內(nèi)的感覺(jué)傳入作用[10,11]。而訓(xùn)練組制模痛覺(jué)閾值的升高明顯低于手術(shù)組，提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在脊神經(jīng)背根損傷后的早期就可以促進(jìn)痛覺(jué)閾值的恢復(fù)。這可能與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能提高內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)相鄰節(jié)段脊髓內(nèi)神經(jīng)元的出芽，活化脊髓網(wǎng)絡(luò)，形成代償適應(yīng)性的感覺(jué)傳導(dǎo)旁路來(lái)傳導(dǎo)感覺(jué)信息[12～14]有關(guān)。

另外，脊神經(jīng)背根損傷后，激活的膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化中發(fā)揮重要作用[15,16]，這也是代償適應(yīng)性感覺(jué)傳導(dǎo)旁路形成的重要影響因素。有研究[17,18]表明，激活的膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)延緩神經(jīng)通路的恢復(fù)和誘導(dǎo)非適應(yīng)性的神經(jīng)重塑。GFAP被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平反映了膠質(zhì)細(xì)胞的激活和膠質(zhì)化的程度，并在一定意義上表明神經(jīng)細(xì)胞損傷的程度[19,20]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生，可以使損傷局部產(chǎn)生瘢痕，阻止損傷神經(jīng)的初級(jí)神經(jīng)元軸突向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)。Iba-1為小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物之一，脊神經(jīng)背根損傷可使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)吞噬組織碎片,分泌炎性介質(zhì)抑制軸突生長(zhǎng)。有研究[21]表明，阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其活性物質(zhì)的釋放能顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛癥狀，說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在感覺(jué)損傷后的修復(fù)過(guò)程中扮演著重要角色。本文結(jié)果顯示，手術(shù)組脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1 OD值增加，這與損傷后感覺(jué)功能顯著下降相一致；訓(xùn)練組GFAP、Iba-1 OD值低于手術(shù)組，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一定程度上抑制了脊髓后角Ⅱ板層的膠質(zhì)反應(yīng)，從而減少膠質(zhì)瘢痕形成，為脊髓突觸的形成以及突觸穩(wěn)定性提供一個(gè)相對(duì)積極的“允許”環(huán)境，有利于代償適應(yīng)性感覺(jué)傳導(dǎo)旁路的形成。

總之，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可恢復(fù)脊神經(jīng)背根損傷大鼠的痛覺(jué)功能，機(jī)制可能與其可抑制脊髓后角Ⅱ板層GFAP、Iba-1表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Matsuura Y, Ohtori S, Iwakura N, et al. Expression of activating transcription factor 3 (ATF3) in uninjured dorsal root ganglion neurons in a lower trunk avulsion pain model in rats[J]. Eur Spine J, 2013,22(8):1794-1799.

[2] Wu L, Wu J, Chang HH, et al. Selective plasticity of primary afferent innervation to the dorsal horn and autonomic nuclei following lumbosacral ventral root avulsion and reimplantation in long term studies[J]. Exp Neurol, 2012,233(2):758-766.

[3] Kachramanoglou C, De Vita E, Thomas DL, et al. Metabolic changes in the spinal cord after brachial plexus root re-implantation[J]. Neurorehabil Neural Repair, 2013,27(2):118-124.

[4] Bozkurt A, Scheffel J, Brook GA, et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis[J]. Behav Brain Res, 2011,219(1):55-62.

[5] Goel RK, Suri V, Suri A, et al. Effect of bone marrow-derived mononuclear cells on nerve regeneration in the transection model of the rat sciatic nerve[J]. J Clin Neurosci, 2009,16(9):1211-1217.

[6] 高晶晶,王玉陽(yáng),石浩,等.強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及kalirin-7表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2015,37(6):406-410.

[7] 周治來(lái),陳銀海,靳安民,等.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)脊髓損傷大鼠Nogo-A、NgR mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(2):143-147.

[8] 侯紅艷,劉詩(shī)翔.周?chē)窠?jīng)損傷康復(fù)治療研究進(jìn)展[J].臨床軍醫(yī)雜志,2012,40(2):482-483.

[9] Park JS, Hoke A. Treadmill exercise induced functional recovery after peripheral nerve repair is associated with increased levels of neurotrophic factors[J]. PLoS One, 2014,9(3):e90245.

[10] Bajrovic F, Sketelj J. Extent of nociceptive dermatomes in adult rats is not primarily maintained by axonal competition[J]. Exp Neurol, 1998,150(1):115-121.

[11] Giaume C, Koulakoff A, Roux L, et al. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions[J]. Nat Rev Neurosci, 2010,11(2):87-89.

[12] Carlstedt T. Nerve root replantation[J]. Neurosurg Clin N Am, 2009,20(1):39-50.

[13] Benitez SU, Barbizan R, Spejo AB, et al. Synaptic plasticity and sensory-motor improvement following fibrin sealant dorsal root reimplantation and mononuclear cell therapy[J]. Front Neuroanat, 2014,8(10):96.

[14] Du Beau A, Shakya Shrestha S, Bannatyne BA, et al. Neurotransmitter phenotypes of descending systems in the rat lumbar spinal cord[J]. Neuroscience, 2012,227(1):67-69.

[15] Verkhratsky A. Physiology of neuronal-glial networking[J]. Neurochem Int, 2010,57(4):332-343.

[16] Papa M, De Luca CD, Petta F, et al. Astrocyte-neuron interplay in maladaptive plasticity[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2014,42(5):35-54.

[17] De Leo JA, Tawfik VL, Lacroix-Fralish ML. The tetrapartite synapse: path to CNS sensitization and chronic pain[J]. Pain, 2006,122(1-2):17-21.

[18] 劉蘇,沈光宇,吳勤峰,等.康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦損傷后大鼠神經(jīng)功能及膠原纖維酸性蛋白和離子鈣接頭分子表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2012,34(6):415-420.

[19] Eggers R, Tannemaat MR, Ehlert EM, et al. A spatio-temporal analysis of motoneuron survival, axonal regeneration and neurotrophic factor expression after lumbar ventral root avulsion and implantation[J]. Exp Neurol, 2010,223(1):207-220.

[20] Ozdemir M, Attar A, Kuzu I, et al. Stem cell therapy in spinal cord injury: in vivo and postmortem tracking of bone marrow mononuclear or mesenchymal stem cells[J]. Stem Cell Reviews, 2012,8(3):953-962.

[21] Takahashi Y, Nakajima Y. Dermatomes in the rat limbs as determined by antidromic stimulation of sensory C-fibers in spinal nerves[J]. Pain, 1996,67(1):197-202.