趙雪峰,王 藝,許廣大

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

論著

小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的建立與穩(wěn)定性分析

趙雪峰,王 藝,許廣大

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

目的探討建立小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的方法，并驗(yàn)證其穩(wěn)定性。方法將50只BALb/c小鼠隨機(jī)分成25只梗阻性結(jié)腸癌模型組(研究組)和25只PBS替代癌細(xì)胞模型組(對(duì)照組)，制模后各組小鼠再分成5個(gè)亞組，分別在制模3天、7天、10天、14天、21天處死，并采用小鼠一般狀態(tài)標(biāo)注法、擬臨床癌性腸梗阻監(jiān)測(cè)法及病理學(xué)方法比較兩組差異。結(jié)果研究組制模成瘤率100%(25/25)。在小鼠模型一般狀態(tài)的數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組與對(duì)照組相比在制模后10天起平均進(jìn)食量、體重及糞便量明顯減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在擬臨床癌性腸梗阻監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組在制模后7天起平均腹圍、腸道內(nèi)壓力及梗阻上段腸管周徑明顯高于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組在制模后7 d起成瘤，制模后14天起腫瘤環(huán)腔生長(zhǎng)，并逐漸出現(xiàn)梗阻性結(jié)腸癌樣改變。結(jié)論小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的建立方法簡(jiǎn)便、腸管損傷程度小、可行、安全、死亡率低，且制模穩(wěn)定性高；反映了臨床梗阻性結(jié)腸癌的病理生理演變過程，為較理想的動(dòng)物模型。

梗阻性結(jié)腸癌；小鼠模型；模型穩(wěn)定性

梗阻性結(jié)腸癌(obstructive colon cancer, OCC)是臨床上較常見的外科急腹癥，約10%～30%結(jié)腸癌病人合并有腸梗阻，其中約80%為老年病人[1]。梗阻性結(jié)腸癌患者，不僅在手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇上，且對(duì)是否有必要延長(zhǎng)術(shù)前準(zhǔn)備施行腫瘤切除加I期吻合，是否行根治性手術(shù)治療以及II期結(jié)腸癌患者術(shù)后是否必須進(jìn)行系統(tǒng)化療等問題上均有分歧[2]。梗阻性結(jié)腸癌患者不論選擇怎樣的手術(shù)治療方式，住院時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)，也對(duì)病人家庭和社會(huì)帶來不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究通過小鼠模型模擬臨床梗阻性結(jié)腸癌，并采用小鼠一般狀態(tài)、擬臨床腸梗阻監(jiān)測(cè)法及病理學(xué)方法比較兩組差異，驗(yàn)證該動(dòng)物模型在操作技術(shù)上的可行性及制模過程中的穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材 料

BALb/c小鼠50只，16～18 g體重，6周齡雌性，于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購買；小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代捐助；小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶消化液及PBS由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及混懸液制備：小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱環(huán)境下，并在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，且2～3 d/次更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)癌細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化液溶解后，1200 r/min離心3 min，棄上清液，加入PBS清洗癌細(xì)胞2次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，并制備成5×107/mL。將制備好的癌細(xì)胞混懸液放入冰浴保存，于30 min內(nèi)進(jìn)行癌細(xì)胞接種。

1.2.2 動(dòng)物模型設(shè)計(jì)：建立模型1周前BALb/c小鼠不進(jìn)行任何刺激。將50只BALb/c小鼠隨機(jī)分成25只梗阻性結(jié)腸癌模型組(研究組)和25只PBS替代癌細(xì)胞模型組(對(duì)照組)，制模后兩組小鼠再分成5個(gè)亞組，分別在制模后3天、7天、10天、14天、21天處死，并觀察兩組的相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 體視顯微鏡輔助下建立的梗阻性結(jié)腸癌模型：制模前給予禁食1 h，但不禁水。依照麻醉預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用七氟醚加簡(jiǎn)易呼吸機(jī)進(jìn)行全身麻醉。常規(guī)術(shù)區(qū)剃毛、消毒皮膚，取臍上正中切口，長(zhǎng)約1.0 cm入腹選定似降結(jié)腸處為結(jié)腸癌種植部位，采用人小腸營(yíng)養(yǎng)管并用PBS進(jìn)行經(jīng)肛清潔灌腸。將一小動(dòng)物專用腸鉗夾閉所定種植部位的近端，待注入5×106/100 μL小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的鼻飼器經(jīng)肛置入至腸鉗夾閉處，注入癌細(xì)胞后退出鼻飼管，同時(shí)立即距近端腸鉗1.0 cm處夾閉另一腸鉗，待3 min后撤除腸鉗。將似降結(jié)腸輕柔送回腹腔后，關(guān)閉兩層腹壁。所有操作過程均在體視顯微鏡(Olympus SZ61TR型；北京)輔助下完成。在制模過程中，腸管應(yīng)注意輕柔鉗夾，不能人為導(dǎo)致機(jī)械性腸梗阻。

1.2.4 梗阻性結(jié)腸癌制模成效標(biāo)準(zhǔn)：(1)成瘤有效；(2)癌性腸梗阻征象；(3)帶瘤存活。腫瘤大小、范圍及環(huán)腔生長(zhǎng)程度等不作為必備項(xiàng)目。

1.2.5 觀察相關(guān)指標(biāo)：小鼠一般狀態(tài)標(biāo)注法：(1)一般情況：觀察小鼠毛光澤度、步態(tài)及活動(dòng)量，2次/d；(2)小鼠進(jìn)食量：測(cè)量小鼠平均進(jìn)食量，1次/d，也包括平均進(jìn)水量；(3)小鼠體重：測(cè)量每只小鼠體重，1次/d；(4)糞便量：觀察糞便性狀，收集每籠小鼠糞便，并測(cè)量平均糞便排出量，1次/d。擬臨床癌性腸梗阻監(jiān)測(cè)法：(1)腹圍測(cè)量：分別在制模當(dāng)日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下測(cè)量小鼠腹圍(單位:mm)；(2)梗阻或制模上段腸管周徑：分別在制模當(dāng)日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下開腹顯露擴(kuò)張的結(jié)腸，采用紙尺測(cè)量梗阻或制模上段擴(kuò)張腸管的最大和最小周徑；測(cè)量公式如下，梗阻或制模上段腸管周徑=(最大周徑+最小周徑)/2 (單位:mm)；(3)腸道內(nèi)壓力測(cè)定：分別在制模當(dāng)日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下開腹顯露回腸末端并用腸鉗夾閉回腸末端，經(jīng)肛插入鼻飼器約3 cm左右連接吊掛生理鹽水的輸液器，觀察生理鹽水液面，停止高度為腸道內(nèi)壓力，單位為mmH2O。病理學(xué)方法：(1)標(biāo)本大體觀：肉眼觀察梗阻上段、梗阻段及梗阻下段腸管的擴(kuò)張、顏色、水腫及破潰程度，完整切取包括回腸末端的結(jié)直腸，縱行剖開腸管后沖洗干凈，判斷梗阻部位，測(cè)量腫瘤大小、范圍及環(huán)腔生長(zhǎng)程度；(2)標(biāo)本顯微鏡下觀：所有標(biāo)本以制模降結(jié)腸段為中心切取，用4% PFA浸泡固定，石蠟包埋并切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤浸潤(rùn)深度等情況。所有可疑病變或存留證據(jù)均性拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩組間相互比較用t-test，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠模型一般狀態(tài)和擬臨床癌性腸梗阻監(jiān)測(cè)分析

研究組制模成瘤率達(dá)100%(25/25)。在小鼠模型一般狀態(tài)的數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組小鼠毛粗糙、步態(tài)遲緩及活動(dòng)量少，并制模后10天起與對(duì)照組相比平均進(jìn)食量、體重及糞便量明顯減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.001,P<0.001及P=0.019)，見圖1。在擬臨床癌性腸梗阻監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組制模后7天起平均腹圍、腸道內(nèi)壓力、梗阻或制模上段腸管周徑明顯高于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，詳見表1。

A：兩組進(jìn)食量數(shù)據(jù)比較；B：兩組體重?cái)?shù)據(jù)比較；C：兩組糞便量數(shù)據(jù)比較圖1 兩組連續(xù)不同時(shí)段一般狀態(tài)的數(shù)據(jù)比較Fig 1 General conditions of data of two groups in consecutive days

Tab 1 Obdominal circumference, intestinal pressure, and circumference of the intestinal which located at upper the obstruction site of two groups at different days

腹圍(mm)梗阻或制模上段腸管周徑(mm)腸道內(nèi)壓力(mmH2O)研究組制模當(dāng)日(0d)93.50±3.709.38±0.4842.50±2.083d94.00±3.7410.75±0.6553.25±2.507d104.00±5.941)2)3)4)12.75±0.655)6)7)8)65.25±2.999)10)11)12)10d120.50±4.801)2)3)4)14.00±0.415)6)7)8)83.25±5.389)10)11)12)14d151.75±12.711)2)3)4)16.63±1.115)6)7)8)118.00±5.729)10)11)12)21d271.00±14.311)2)3)4)21.25±1.045)6)7)8)149.25±5.859)10)11)12)對(duì)照組制模當(dāng)日(0d)93.00±4.409.50±0.4142.50±2.383d93.25±3.3010.88±0.6354.00±2.947d94.00±2.319.50±0.4143.25±1.7110d95.50±3.119.63±0.2543.50±1.2914d97.00±3.749.50±0.4143.75±1.7121d101.25±4.039.75±0.6545.75±1.89

1)5)9)與研究組0天相比，均為P<0.05；2)6)10)與研究組3天相比，均為P<0.05；3)7)11)與對(duì)照組0天相比，P<0.05；4)8)12)與相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比，均為P<0.05

2.2 小鼠模型病理學(xué)檢測(cè)分析

在病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析中，發(fā)現(xiàn)研究組在制模7天后起成瘤，制模14天后起腫瘤環(huán)腔生長(zhǎng)，并逐漸出現(xiàn)梗阻性結(jié)腸癌改變，見圖2。提示制模后14天是小鼠模型成敗的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，也是監(jiān)測(cè)制模穩(wěn)定性或安全性的起始點(diǎn)。

A：制模后3天腹部情況，無腸管擴(kuò)張；B：制模后7 d腹部情況，腸管開始擴(kuò)張；C：制模后10天腹部情況，結(jié)腸擴(kuò)張明顯；D：制模后14天腹部情況，開始出現(xiàn)腸梗阻樣改變；E：制模后21天腹部情況，結(jié)腸高度擴(kuò)張，頻臨死亡；F：體視顯微鏡下觀察的制模14天后起梗阻端腸管的大體觀；G：體視顯微鏡下觀察的制模14天后起環(huán)腔生長(zhǎng)的結(jié)腸腫瘤大體觀；H：顯微鏡下可見浸潤(rùn)至黏膜下層、肌層的梗阻性結(jié)腸癌模型標(biāo)本，放大倍數(shù)為200倍，標(biāo)尺為100 μm。圖2 梗阻性結(jié)腸癌模型制作的圍手術(shù)及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Prioperation and pathological ressults in obstructive colon cancer BALb/c mouse model

3 討 論

梗阻性結(jié)腸癌是腫瘤晚期表現(xiàn)，且由于結(jié)腸入口的回盲瓣解剖的影響，相當(dāng)大小的結(jié)腸癌往往出現(xiàn)閉襻性低位梗阻。梗阻性結(jié)腸癌與非梗阻性結(jié)腸癌相比，其治療原則為腫瘤切除為主導(dǎo)，并有效延長(zhǎng)生存時(shí)間及改善生存質(zhì)量[3]。臨床研究證實(shí)，持續(xù)高質(zhì)量改進(jìn)術(shù)前、術(shù)中腸梗阻灌洗后，梗阻性結(jié)腸癌實(shí)施擇期手術(shù)治療的療效明顯優(yōu)于急診手術(shù)，且擇期施行I期吻合術(shù)后吻合口瘺等安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也明顯低于急診手術(shù)[4]。但目前針對(duì)梗阻性結(jié)腸癌的基礎(chǔ)研究較少。

對(duì)于炎性腸梗阻的動(dòng)物模型制作，主要采用棉簽擦拭腸管法，此操作法為非機(jī)械性腸梗阻模型制作方法[5-6]。通過術(shù)后胃腸道推進(jìn)功能試驗(yàn)、腸管MDA含量、腸管SOD活性檢測(cè)以及Real-time PCR檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、MIP-1α來評(píng)估不同手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)大鼠術(shù)后炎性腸梗阻的影響。對(duì)于不完全性腸梗阻的動(dòng)物模型制作，主要采用套環(huán)法，此操作法為機(jī)械性腸梗阻模型制作方法[7-8]。通過Lefort式評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、梗阻上段腸管平均周徑以及Haglund和Osterberg損傷評(píng)分來評(píng)估套環(huán)法與絲線法相比的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步研究早期臨床不完全腸梗阻提供良好的動(dòng)物模型平臺(tái)。

從基礎(chǔ)研究著手，本研究模擬了臨床梗阻性結(jié)腸癌動(dòng)物模型，也符合本研究設(shè)計(jì)的初衷。其小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的優(yōu)越性在于：(1)操作簡(jiǎn)便，易模仿；(2)非機(jī)械性腸梗阻或炎性腸梗阻模型；(3)模型成功率極高；(4)制模穩(wěn)定性高；(5)符合結(jié)腸癌浸潤(rùn)生長(zhǎng)方式；(6)制模選擇了常見的左半結(jié)腸。是為較理想的梗阻性結(jié)腸癌模型。本研究將腫瘤種植部位選取在操作相對(duì)方便的距肛門較近的似降結(jié)腸解剖位置，并在5×106CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株條件下制模速效，且腫瘤生長(zhǎng)方式為浸潤(rùn)性環(huán)腔生長(zhǎng)，但模型所致梗阻與腫瘤大小和狹窄程度并無直接相關(guān)(P>0.05)。由于本研究選取了單一小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株，而數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上相對(duì)偏面。因此，非常有必要在多種人結(jié)腸癌細(xì)胞株選項(xiàng)的裸鼠梗阻性結(jié)腸癌模型中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的建立方法簡(jiǎn)便、腸道損傷程度小、可行、安全、死亡率低，且制模穩(wěn)定性高；本研究反映了臨床梗阻性結(jié)腸癌的病理生理演變過程，為較理想的動(dòng)物模型；為深入了解梗阻性結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)理或?qū)で蟾佑行У脑\治手段提供優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物模型平臺(tái)。

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EstablishmentandstabilityanalysisofostructivecoloncancermodelinexperimentalBALb/cmice

ZHAO Xuefeng, WANG Yi, XU Guangda

(DepartmentofGeneralSurgery,DalianUniversityAffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

ObjectiveTo establish of obstructive colon cancer model in BALb/c mice with method and verify its stability.MethodsThe 50 BALb/c mice were randomized into two groups, 25 obstructive colon cancer model group (study group) and 25 PBS replaces cancer cells model group (control group). After the model, the mice were divided into five sub-groups, and executed in postoperative 3, 7, 10, 14 and 21 day respectively. BALb/c mice of general conditions, simulative cancerous intestinal obstruction of surveilance method, and histopathological examination were evaluated in two groups.ResultsThe rates of tumor formation was 100.0% (25/25) in the study group. BALb/c mice model of general conditions of data analysis, study group had a significantly losses mean food intake, weight, and excrement in the postoperative 10 days (P<0.05). The simulative cancerous intestinal obstruction of surveilance method of data analysis, study group showed significantly mean increase obdominal circumference, intestinal pressure, and circumference of the intestinal which located at upper the obstruction site in the postoperative 7 days (P<0.05). The histopathological examination of data analysis, tumor formation time was postoperative 7 days, and colon circumferential growth and obstructive colon cancer of times were postoperative 14 days.ConclusionThe modified method to establish a BALb/c mice of obstructive colon cancer model are operational simple, reduces intestinal injury, technically feasible, oncological safety, loss mortality, and higher stability. That has basically reflected pathological physiological evolution of clinical obstructive colon cancer, and are desired animal models.

obstructive colon cancer; BALb/c mice model; model stability

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201602037)；大連大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(20151QL019)

趙雪峰(1974-)，男，副教授。E-mail:zhaoxuefeng74@hanmail.net

許廣大，教授。E-mail:XuGuangDa1688@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.15

R735.3+5

A

1671-7295(2017)06-0584-05

趙雪峰，王藝，許廣大.小鼠梗阻性結(jié)腸癌模型的建立與穩(wěn)定性分析[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(6)：584-588.

2017-06-26；

2017-11-28)