劉　釗　曾燦彪　黃　浩　柯　玲　陳星合

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶　526061）

希夫堿的應用涉及催化領域、分析化學領域、功能材料領域、生物和醫(yī)學領域等，因此對希夫堿進行研究并深入探索它的結構、化合物的穩(wěn)定性、化學性質、生物特性等有著重要意義。水楊醛系列希夫堿備受矚目，因其具有良好的抑菌和抗氧化性,而水楊醛本身也有良好的藥理作用，還應用于止痛、抗炎、抗病毒等方面。希夫堿的官能團(RC=N)與葉酸分子中的喋啶構造類似，兩者對葉酸還原酶產生競爭性抑制，葉酸的生成因此作用受到抑制，從而使細菌體內核苷酸和氨基酸的合成受阻，導致細菌停止生長和繁殖。用于測定抗菌物質抑菌效果的主要方法有定量稀釋法（MIC法） 和定性擴散法。擴散法通過測量在培養(yǎng)基上含樣品紙片的抑菌圈直徑，判斷其對細菌的抑菌效果，也可以用含不同濃度樣品的濾紙片進行抑菌試驗。目前，對希夫堿的抗氧化能力有不少研究和報道。樊素芳等人探討了殼寡糖水楊醛系列希夫堿的抗氧化活性，并與殼寡糖對照比較。本文以3,5-二溴水楊醛和4-乙基苯胺為底物，設計并合成新型希夫堿，對其結構進行表征，并研究其生物活性。采用溶劑熱法合成希夫堿，用紅外、紫外光譜及核磁共振譜圖等進行結構表征，用紙片擴散法和DPPH法進行抑菌活性及抗氧化活性的研究，以期為進一步研究3,5-二溴水楊醛類希夫堿及其生物活性提供參考依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

試劑：3,5-二溴水楊醛，純度98%，Aladdin Industrial Corporation；4－乙基苯胺，純度99%，Aladdin Industrial Corporation； DPPH/2,2－二苯基－1－苦基肼，BR，純度96%，上海源葉生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺，AR，西隴化工股份有限公司；其他常規(guī)試劑，均為分析純。

儀器：UV-2600紫外可見分光光度計，SHIMADZU CIRPORATION KYOTO JAPAN；FTIR-8400S紅外光譜儀，CE日本島津制作所；AVANCEIII 400MHz核磁共振儀，德國布魯克公司等。

1.2　方法

1.2.1　希夫堿的合成

稱取5 mmol（約1.399 5 g） 3,5-二溴水楊醛置于燒杯中，加入10 mL無水乙醇，水浴致其溶解，溶解后轉入100 mL的圓底燒瓶中。稱取5 mmol（約0.610 9 g） 4-乙基苯胺，用10 mL無水乙醇溶解至呈無色溶液，將無色溶液倒入50 mL的燒杯中。將溶液混合加入圓底燒瓶，安裝好回流裝置置于集熱式磁力攪拌器中攪拌，65℃恒溫回流反應2.5 h。用薄層色譜法（TLC：thin-layer chromatography）跟蹤反應并確定其反應終點。展開劑為石油醚和乙酸乙酯（體積比4∶1），GF254薄層層析硅膠板。

新希夫堿合成過程的化學方程式如圖1所示。

1.2.2　紅外光譜對新希夫堿結構的表征

圖1　新希夫堿化合成的化學反應方程式

采用FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀對新產物進行測定，取微量經過重結晶洗滌純化的新希夫堿產物制成薄片，分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍400 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù)20次。

1.2.3　紫外光譜對新希夫堿結構的表征

取微量干燥的希夫堿樣品，測量掃描范圍200 nm～800 nm。用正已烷配制成濃度適當?shù)娜芤?，使得所測定樣品的吸收頂峰吸收值落在記錄范圍0～0.4內。同時用正已烷做空白扣除。

1.2.4　核磁共振H譜圖對新希夫堿結構的表征

在核磁共振分析中，化學位移在掃場時用磁感應強度的改變來表示。用TMS（四甲基硅烷） 作內標，在新希夫堿溶液中加入少許TMS，以TMS中氫核共振時的磁感應強度作為標準，將它的化學位移規(guī)定為0。

核磁共振H譜選用CDCl3（氘代氯仿） 為溶劑，400 MHz的條件下TMS內標法測定新希夫堿的1H NMR。

同時通過化學軟件Chemdraw模擬出希夫堿的理論氫譜圖、氫譜峰圖等對新化合物進行表征，進一步確定其化合物的結構。

1.2.5　核磁共振C譜圖對新希夫堿結構的表征

核磁共振C譜選用CDCl3為溶劑，100 MHz的條件下TMS內標法測定新希夫堿的13CNMR。

通過Chemdraw模擬出希夫堿的理論碳譜圖、碳譜峰圖等對新化合物進行表征，確定所合成的希夫堿為理論中的希夫堿。

1.2.6　熔點的測定

將樣品先用5℃/min粗測，粗測完成后，再將起始溫度設置成比粗測熔點低5℃，最后用升溫速率1℃/min精測。

1.2.7　溶解性的測定

采用不同溶劑，將保存良好，干燥的樣品溶于其中，觀察其溶解性；溶劑包括N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、甲醇和水。

1.2.8　新希夫堿抑菌活性的研究

準備好牛肉膏培養(yǎng)基、沙氏勞保培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、擴散平板。用無菌操作分別將細菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草桿菌）活化。取活化好的細菌接入9 mL無菌生理鹽水中，充分分散菌體。采用10倍系列稀釋法，制備10倍系列稀釋菌懸液。各梯度菌懸液進行涂布記數(shù)，每次用移液管吸取0.2 mL該梯度菌懸液于倒好平板的牛肉膏培養(yǎng)皿中，采用畫半圓法使菌液分布均勻，涂布完成后正置15 min，將平板翻轉，37℃下培養(yǎng)24 h。選取細菌濃度范圍在108CFU/mL的試管做菌懸液。

取出已活化的霉菌菌種，洗脫于9 mL滅菌生理鹽水中，制成孢子懸浮液。對霉菌懸浮液的孢子數(shù)進行計數(shù)。以DMF為溶劑，分別稱取適量的待測新希夫堿于50 mL燒杯中，分別制得質量濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、1 mg/mL的溶液。將足夠數(shù)量的濾紙片（直徑為6 mm） 浸泡于溶液中，充分浸泡2 h備用（同時做DMF溶液空白對照）。量取0.2 mL菌懸液，將其加入并涂布于冷卻凝固完成的平板表面，將均勻涂布0.2 mL菌液的平板平均分為4個區(qū)域，分別對應空白組（DMF），濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、1 mg/mL的樣品液，做好標記，用無菌鑷子依次夾取浸泡于10mg/mL、5mg/mL、1 mg/mL的DMF溶液的濾紙片，放置于平板內固定，平行試驗3次。細菌于37℃活化24 h，真菌于25℃活化48 h。待活化完畢后，取出培養(yǎng)基，觀察抑菌結果，用游標卡尺量取抑菌圈直徑，記錄平均值。

1.2.9　新希夫堿的抗氧化活性研究

準確稱取0.0100 gDPPH（MDPPH=394.32） 固體，用無水乙醇溶解并定容于250 mL容量瓶，配成0.1 mmol/L DPPH溶液置于暗處備用。用DMF制得系列濃度的新希夫堿樣液，以及系列濃度的Vc溶液（對照液）。用3 mLDMF溶液與1 mL無水乙醇溶液作空白調零。分別取3 mL DMF和1 mL DPPH溶液于比色管中，置于暗處反應30 min，在517 nm處比色，記錄數(shù)值，記為A0。分別取3 mL不同濃度希夫堿溶液和1 mLDPPH溶液于比色管中，置于暗處反應30 min，在517 nm處比色，記為Ai。分別取3 mL不同濃度希夫堿溶液和1 mL無水乙醇溶液于比色管中，置于暗處反應30 min，在517 nm處比色，記為Aj。DPPH自由基清除能力的計算：清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。算出不同濃度希夫堿溶液對DPPH的清除能力，繪制出散點折線圖。計算出希夫堿與Vc溶液對DPPH的半數(shù)清除率（IC50）。

2　結果與分析

2.1　合成結果

新希夫堿為干燥橙紅色晶體，總產量為1.4929g，產率74.3%，樣品在空氣中穩(wěn)定存在。

2.2　表征結果分析

2.2.1　紅外光譜對新希夫堿結構的表征分析

紅外光譜測試結果如圖2所示。

圖2　新希夫堿的紅外吸收光譜圖

通過譜圖分析，在波數(shù)為1 655 cm-1～1 900 cm-1處無明顯的強吸收峰，表明-C=O消失，新產物產生。在波數(shù)為1 652 cm-1處的強特征吸收峰為-CH=N-的伸縮振動，此為表征希夫堿結構的特征官能團已經生成并被檢測到。波數(shù)為1 504 cm-1的特征吸收峰為苯環(huán)的骨架振動，在波數(shù)為706 cm-1的特征吸收表明苯環(huán)上有1，2，3-三取代物，3 505 cm-1處則為羥基的伸縮振動吸收峰，在605 cm-1處溴的吸收峰，波數(shù)為2 450 cm-1處推斷為亞甲基特征吸收峰。因此，紅外譜圖表征結果與新產物希夫堿的結構基本吻合。

2.2.2　紫外光譜對新希夫堿結構的表征分析

紫外光譜掃描結果如圖3所示。

圖3　新希夫堿的紫外吸收光譜圖

從圖3中可以看出，希夫堿在202 nm、231 nm、275 nm、316 nm、332 nm、359 nm處有最大吸收峰，特征吸收波長分析結果見表1。

表1　特征吸收波長分析

從表1中可以看出，原本的-C=O結構消失，新產物產生。這進一步證明了N原子進行了配位及亞氨基的生成。

2.2.3　核磁共振H譜圖對新希夫堿結構的表征分析

通過Chemdraw模擬出希夫堿的理論氫譜圖、氫譜峰圖，分別見圖4、圖5。

圖4　新希夫堿模擬的H譜圖

圖5　新希夫堿模擬的H譜峰圖

核磁共振H譜圖如圖6所示。

圖6　新希夫堿的1H NMR譜圖

通過新希夫堿的1H NMR譜圖數(shù)據分析，化學位移 δ=7.447 5 μm～7.451 3 μm是 CDCl3的溶劑峰，化學位移δ=8.514 8 μm為與苯環(huán)相連接的-CH=N-基團中H，共軛作用增強使化學位移向低電場移動，表明產物已經具有希夫堿結構。在化學位移δ=7.217 4 μm～7.268 9 μm處存在的多重峰為苯乙基環(huán)上的質子吸收峰，在δ=14.659 0 μm的單峰為3,5-二溴水楊醛苯環(huán)上的-OH引起，δ=2.664 1 μm～2.702 2 μm的吸收峰為苯乙基環(huán)上-CH2-的質子峰，在 δ=1.244 9 μm～1.270 3 μm的吸收峰為苯乙基環(huán)上-CH3的質子峰，在化學位移δ=7.711 1 μm～7.715 0 μm處的吸收峰為 3,5- 二溴水楊醛苯環(huán)上的質子吸收峰。從測試結果推斷其質子在苯環(huán)上以及其他位上的結構與目標產物結構基本一致。

2.2.4　核磁共振C譜圖對新希夫堿結構的表征分析

通過Chemdraw模擬出希夫堿的理論碳譜圖、碳譜峰圖，分別見圖7、圖8。

圖7　新希夫堿模擬的C譜圖

圖8　希夫堿模擬的C譜峰圖

核磁共振C譜圖如圖9所示。

圖9　新希夫堿的13C NMR譜圖

通過新希夫堿的13CNMR譜圖數(shù)據分析，化學位移δ=158.7536μm為-C=N-的碳峰，δ=28.5231μm為-CH2-的碳峰，δ=15.517 9 μm為 -CH3的碳峰，δ=110.0760μm和112.2518μm為苯環(huán)連著2個溴的碳峰，δ=129.074 5 μm和 δ=120.736 1 μm ～121.145 5 μm是苯乙基環(huán)上的-CH的碳峰，δ=133.264 4 μm和δ=137.887 6 μm為 3，5- 二溴水楊醛苯環(huán)上的 -CH的碳峰，δ=157.537 0 μm是連著 -OH的碳峰，δ=144.557 6 μm和 δ=144.101 1 μm是苯環(huán)上與 -C=N-相連2個C上的碳峰。δ=76.831 4 μm-77.254 8 μm為CDCl3溶劑峰。從測試結果推斷其碳原子在苯環(huán)以及其他位上的結構與目標產物結構基本一致。

2.3　新希夫堿的熔點測定結果

熔點約為102.6℃。

2.4　新希夫堿的溶解性

新希夫堿的溶解性測定結果見表2。

表2　新希夫堿的溶解性

綜合新希夫堿化合物的表征數(shù)據與分析結果，表明所合成產物的結構與理論結構基本相同，且產物產率較高。

2.5　抗菌活性測定結果

采用濾紙片擴散法測定希夫堿對各細菌和霉菌的抑菌活性，希夫堿在不同濃度下抑菌圈直徑結果如表3所示。

表3　新希夫堿在不同濃度下的抑菌圈直徑(mm)

從表3中看出，新希夫堿對細菌具有良好的抑菌性，當溶液質量濃度達到5 mg/mL或10 mg/mL時，對細菌均可達到高度敏感。其中當質量濃度為10 mg/mL時，對大腸桿菌的抑菌圈可達到20 mm以上，對大腸桿菌的抑菌效果為極度敏感，抑菌效果十分顯著。當溶液質量濃度在1 mg/mL時，除大腸桿菌外，均達到中等敏感水平。DMF溶液對各細菌或霉菌的抑菌圈均為6 mm，表明它對各菌均沒有抑制作用。此外，當溶液質量濃度為5 mg/mL時，新希夫堿對沙門氏菌、枯草桿菌的抑菌圈比在10 mg/mL時的直徑大，這表明抑菌圈大小并不是簡單隨著溶液質量濃度的增大而增強，而是在其質量濃度范圍內有最大值，此時達到最強的抑菌效果。在對霉菌的抑制效果中，本文中合成的新希夫堿對黑根霉的抗菌性沒有被檢測出，對黑曲霉和毛霉的抑菌圈效果隨新希夫堿質量濃度的增加而略有提高。依據本文的抑菌評價標準，除在1 mg/mL時對毛霉沒有抑菌圈的產生，新希夫堿對黑曲霉和毛霉的抑菌結果均為低度敏感，存在一定的抑菌效果。

2.6　抗氧化能力的測定結果

使用UVmini-1240（SHIMADZU） 測定紫外吸光度，得出清除能力工作曲線，新希夫堿和Vc溶液對DPPH自由基清除能力如下頁圖10、下頁圖11所示。

圖10　希夫堿對DPPH的清除能力

由圖10和圖11可以看出，在一定范圍內，新希夫堿和Vc溶液對DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)出較好的劑量效應關系，隨試驗溶液質量濃度的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢。根據線性方程y=4.5213x+18.759，R2=0.988，算出希出堿對DPPH自由基的半數(shù)清除率為6.92 mg/mL。根據線性方程y=1431.9x+38.638，R2=0.918 3，算出希出堿對DPPH自由基的半數(shù)清除率為0.007 9 mg/mL。IC50的結果表明，與Vc相比，新希夫堿對DPPH自由基的清除能力相對較弱。當IC50小于10 mg/mL時，則說明抗氧化劑具有良好的自由基清除活性。依據此標準，化合物的IC50為6.92 mg/mL，小于10 mg/mL，其對DPPH自由基的清除能力相對較弱，但也保有一定的自由基清除活性。

3　結論

通過用3,5-二溴水楊醛和4-乙基苯胺合成的新希夫堿樣品為橙紅色晶體，產率為74.3%，熔點約為102.6℃。通過紅外、紫外光譜分析、核磁共振譜圖分析對新希夫堿進行結構表征，表征的結果表明合成產物與目標產物基本相一致。采用濾紙片法對希夫堿樣品進行抑菌活性測定，結果表明，新型希夫堿對細菌具有良好的抑制性，同時它對細菌的抑制效果整體高于真菌。對細菌的抑菌效果普遍在高濃度時達到高度敏感，其中對大腸桿菌可達到極度敏感程度。在抗氧化活性測定結果中，新希夫堿對DPPH自由基的IC50為6.92 mg/mL，清除

DPPH自由基的能力明顯比Vc弱，但仍具備一定的抗氧化活性。

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