龐緒良 趙培然 董建方 葉新輝 李連之

(聊城大學化學化工學院，山東聊城252059)

水楊醛縮乙二胺希夫堿與牛血清白蛋白的相互作用及抑菌活性研究①

龐緒良 趙培然 董建方 葉新輝 李連之

(聊城大學化學化工學院，山東聊城252059)

合成了水楊醛縮乙二胺希夫堿化合物.利用紫外可見吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜法研究了水楊醛縮乙二胺希夫堿與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.結果表明，該希夫堿化合物與BSA形成了復合物，導致BSA的構象發(fā)生變化，使BSA的內源性熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，計算得到了希夫堿化合物與BSA相互作用的熱力學參數.體外抑菌實驗表明該希夫堿對大腸桿菌具有一定的抑菌活性.

水楊醛縮乙二胺希夫堿，牛血清白蛋白，光譜，抑菌活性

0 引言

希夫堿(Schiff base)是指由醛或酮與伯氨縮合而成的含有亞胺或甲亞胺的一類有機化合物，希夫堿化合物是由H. Schiff在1864年首次發(fā)現而得名[1]，隨后希夫堿化合物被廣泛深入的研究[2].希夫堿中含有碳氮雙鍵，其雜化軌道上的N原子具有孤對電子，因而在化學和生化反應中具有重要意義.希夫堿是一類重要的化學分析試劑和良好的有機化學配體，其本身還具有一定的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒的生物學活性[3].研究表明，希夫堿及其衍生物已廣泛應用于醫(yī)療、催化、材料、生化反應等方面.蛋白質作為生命功能的執(zhí)行者，是生物體的重要組成成分.血清白蛋白是可溶性蛋白質，許多小分子化合物藥物通過與人血清白蛋白結合運輸到體內.近些年來，有很多關于希夫堿及其衍生物與BSA相互作用的研究報道[4-6].因此，研究藥物分子與蛋白的結合方式及其在血液中的運輸機制是非常重要的[7].我們曾報道過L-絲氨酸水楊醛希夫堿鎳(Ⅱ)配合物的合成、結構及與DNA的相互作用[8].本文中我們合成了水楊醛縮乙二胺希夫堿化合物，利用紫外可見吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜法研究了該化合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙二胺、水楊醛、無水甲醇均為市售分析純試劑，BSA購自北京拜爾迪生物技術有限公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自AMRESCO公司，BSA存儲液用10 mmol·L-1Tris-HCl (pH=7.1)緩沖液配制，濃度由(ε280=43 824 L·mol-1·cm-1確定.

Nicolet 460 型紅外光譜儀(KBr壓片)，X-4顯微熔點儀(未經矯正)，Lambda 750型紫外分光光度計(Perkin Elmer, 美國)，F-7000熒光光譜儀，JASCO J-810 型圓二色光譜儀(Japan).

1.2 希夫堿化合物的合成與表征

量取0.05 mol(3.5 ml)的乙二胺于圓底燒瓶中，并加入30 mL甲醇，在50 ℃的條件下加熱攪拌0.5 h，然后慢慢滴加0.1 mol (21 mL)的水楊醛溶液，加熱回流2 h后泠卻至室溫，過濾至平底試管中，在室溫下緩慢揮發(fā)，一周后得到黃色片狀晶體，產率約76%.該希夫堿晶體熔點為125 ℃.希夫堿化合物的IR(cm-1)：3 433.6 (s, υO-H)；1 636.2 (s, υC=N).希夫堿的結構在Bruker Smart-1000 CCD 型單晶衍射儀上進行了測定.

1.3 希夫堿化合物與BSA的相互作用

1.3.1 紫外可見吸收光譜.用10 mmol·L-1Tris-HCl(pH=7.1)緩沖溶液配制一系列試樣，保持BSA(8.0 μmol·L-1)的濃度不變，希夫堿化合物的濃度逐漸增大，將配好的試樣混合均勻后放置在室溫條件下2.5 h后測定BSA的紫外可見吸收光譜，用緩沖溶液或不同濃度化合物的溶液作為參比，光譜在240-400 nm 波長范圍內測定.

1.3.2 熒光光譜.用10 mmol·L-1Tris-HCl (pH=7.1)緩沖溶液配制一系列試樣，保持BSA(8.0 μmol·L-1)濃度不變，逐漸加大希夫堿化合物的濃度.將試樣混合均勻，然后在室溫條件下放置2.5 h，分別于298 K、303 K和308 K三個溫度下恒溫后測定BSA的熒光光譜.激發(fā)波長: 280 nm，發(fā)射波長范圍：290-460 nm，狹縫寬度：Ex=Em=2.5 nm；掃描速度：600 nm·min-1.

1.3.3 圓二色光譜測定.用10 mmol·L-1Tris-HCl(pH=7.1)緩沖液配制試樣，其中BSA濃度為4.5×10-7mol·L-1，化合物的濃度是10 μmol·L-1，測定時以同濃度的緩沖溶液或化合物緩沖溶液作為參比，分別測定BSA及BSA與化合物混合液在190-250 nm波長范圍內的圓二色光譜，混合均勻室溫下放置2.5 h后測定.掃描速度為200 nm·min-1，路徑長度為 1 cm，響應時間為1 s，累積次數為3次.

1.4 抑菌實驗

用紙片擴散法進行體外抑菌實驗.將大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)菌液(A550= 0.75)均勻地涂在M-H瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，然后將滅菌過的濾紙片(8.0 mm)平鋪在培養(yǎng)皿上，緩慢向濾紙片上注上10 μL濃度為2.5 mmol·L-1希夫堿的水溶液，另取一個濾紙片注上10 μL蒸餾水作為參比，最后放在恒溫培養(yǎng)箱內在32 ℃培養(yǎng)20 h，觀察抑菌圈，測量抑菌圈的直徑.

2 結果與討論

2.1 化合物的表征

紅外光譜采用KBr壓片法， 在400-4 000 cm-1范圍收集數據.希夫堿化合物在3 433.6 cm-1處的強吸收峰是由于O-H的伸縮振動，1 636.2 cm-1處強而尖的特征吸收峰可以說明希夫堿(CN)結構的生成.化合物的晶體結構測定結果與文獻[9]一致.圖1為該希夫堿化合物的分子結構圖.

圖1 希夫堿化合物的分子結構

2.2 希夫堿化合物與BSA的作用

圖2 不同濃度的希夫堿存在時BSA的紫外吸收光譜，[BSA]=8.0×10-6mol·L-1，[希夫堿]=0, 8.3×10-6, 1.66×10-5，2.49×10-5，3.32×10-5，4.15×10-5, 4.98×10-5 mol·L-1.

2.2.1 紫外可見吸收光譜.在研究小分子化合物與蛋白質的作用中，常用紫外可見吸收光譜來檢測蛋白質的構象變化.BSA在280 nm左右的吸收峰是由于蛋白質肽鏈上色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸上的雜環(huán)π-π*和n-π*的躍遷引起的[10].圖2為不同濃度的希夫堿存在時BSA的紫外吸收光譜(希夫堿化合物本身在278 nm處吸收很弱，沒有吸收峰).從圖2中可以看出，隨著希夫堿濃度的增加，在278 nm處的吸收峰逐漸上升且略有藍移，而且在400 nm處出現了一個新的吸收峰，此峰隨著希夫堿濃度的增加明顯增大.這說明該希夫堿化合物與BSA上的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用，形成了基態(tài)復合物.

2.2.2 熒光光譜.熒光光譜法具有選擇性好且靈敏度高的優(yōu)點.因此，被廣泛應用于研究藥物分子與蛋白的作用中.BSA中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是熒光生色基團，而且這些氨基酸殘基對微環(huán)境的變化都較敏感，通常作為熒光光譜的檢測靶標.在一定激發(fā)波長下，BSA的熒光光譜的變化在一定程度上反映了蛋白質熒光生色基團的微環(huán)境變化[11].圖3、圖4和圖5為不同溫度下，不同濃度的希夫堿對BSA溶液的熒光猝滅光譜.由圖3可以看出，隨著希夫堿濃度的增加，BSA在330 nm處的熒光強度逐漸降低，說明該希夫堿化合物與BSA發(fā)生了相互作用，影響了蛋白質熒光生色團微環(huán)境的變化，從而導致BSA的內源性猝滅.

圖3 298 K下，希夫堿化合物對BSA 的熒光猝滅光譜，[BSA]=1.38×10-6 mol·L-1；[希夫堿]=0, 8.33×10-6, 1.66×10-5, 2.49×10-5, 3.32×10-5, 4.15×10-5 mol·L-1內嵌圖為F/F0對[Q]作圖

圖4 303 K下，希夫堿化合物對BSA 的熒光猝滅光譜，[BSA]=1.38×10-6 mol·L；[希夫堿]=0, 8.33×10-6, 1.66×10-5, 2.49×10-5, 3.32×10-5 , 4.15×10-5 mol·L-1內嵌圖為F/F0對[Q]作圖

圖5 308 K下，希夫堿化合物對BSA 的熒光猝滅光譜，[BSA]=1.38×10-6 mol·L；[希夫堿]=0, 8.33×10-6, 1.66×10-5, 2.49×10-5, 3.32×10-5 , 4.15×10-5 mol·L-1 內嵌圖為F/F0對[Q]作圖

熒光猝滅有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩類.動態(tài)猝滅是與擴散有關的，當溫度升高時，溶液的黏度將會下降，從而導致分子的運動加快，從而使分子的擴散系數增大，猝滅常數就會增大.當發(fā)生靜態(tài)猝滅時，隨著溫度的升高會引起復合物的穩(wěn)定性降低，使猝滅程度減弱，猝滅常數就會減小.為了解希夫堿化合物對BSA的猝滅類型，通常先按動態(tài)猝滅處理，常使用Stern-Volmer方程[12]

F0/F=1 +Kqτ0[Q]=1 +Ksv[Q]，

(1)

式中用F0和F分別表示未加入希夫堿和加入希夫堿后的熒光峰強度；Kq是BSA猝滅常數，τ0為沒有加猝滅劑時熒光物質的熒光壽命，其值約為10-8s；Ksv是Stern-Volmer 猝滅常數；[Q]來表示希夫堿化合物的濃度.圖3、圖4和圖5中的內嵌圖分別為該體系在不同溫度下的熒光猝滅光譜和F0/F對[Q]作圖.由F0/F對[Q]作圖求得化合物的猝滅常數Ksv(298 K)= 1.36×104L·mol-1，Ksv(303 K)=9.22×103L·mol-1，Ksv(308 K)=8.25×103L·mol-1. 進而可求得Kq(298 K)=1.36×1012L·mol-1·s-1，Kq(303 K)=9.22×1011L·mol-1·s-1，Kq(308 K)=8.25×1011L·mol-1·s-1.可以看出，希夫堿化合物的Kq要遠遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數2×1010L·mol-1·s-1.隨著溫度的升高，其猝滅常數也逐漸減小，進一步說明了該希夫堿化合物對BSA的猝滅過程并不是由分子碰撞和擴散所產生的動態(tài)猝滅，而是希夫堿化合物與BSA相互作用后形成了不發(fā)光的基態(tài)復合物而引起的靜態(tài)猝滅.

希夫堿化合物對BSA的作用方式屬于兩者之間形成復合物的靜態(tài)猝滅.通常假設BSA上有n個且相同的結合位點，則BSA的熒光強度與希夫堿化合物濃度的關系可以用下面的雙對數公式進行描述[13]

lg[(F0-F)/F] = lgKA+nlg[Q],

(2)

圖6 lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖

式中KA是結合常數，n是結合位點數，[Q]是猝滅劑的濃度.圖6是lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖，由該圖可以求得在不同溫度下的結合常數分別為KA(298 K)=3.07×105L·mol-1，KA(303 K)=6.69×103L·mol-1，KA(308 K)=4.96×103L·mol-1；結合位點數分別為：n(298 K) = 1.3，n(303 K)=0.92，n(308 K)=0.95.這說明該希夫堿化合物與BSA是以1∶1結合的，即兩者之間存在一個結合位點.

從熱力學的觀點可考察希夫堿化合物與BSA之間的結合力(氫鍵、疏水鍵、靜電作用或范德華力等).根據求得的不同溫度下的結合常數(KA)，運用熱力學公式(3)來計算反應的自由能變值(ΔG).

ΔG=-RTlnKA，

(3)

ΔG=ΔH-TΔS.

(4)

通過計算求得ΔG(298 K) =-31.3 kJ·mol-1，ΔG(303 K) =-22.2 kJ·mol-1，ΔG(308 K) =-21.8 kJ·mol-1.利用反應自由能變值對溫度作圖求得焓變(ΔH)和熵變(ΔS)分別為：ΔH=-313.0 kJ·mol-1，ΔS=-950 J·mol-1·K-1.Ross[14]等人經過大量的研究，得出了小分子與蛋白質的結合作用力與熱力學參數之間的關系，當焓變與熵變同時大于零時，可認為疏水作用力占主導；當焓變與熵變同時小于零時，則可認為是氫鍵或者范德華力；如果焓變較小(或接近于零)且熵變大于零，則可能為靜電作用力.因此，我們得出希夫堿與BSA之間主要靠氫鍵或范德華力相互作用.但由于BSA的結構復雜，它與希夫堿化合物之間不可能是單一的作用力，而是多種作用力之間的相互結合.

2.2.3 圓二色光譜.圓二色光譜法是研究蛋白質構象變化及與小分子作用的一種快捷、較準確的方法.圖7是該希夫堿化合物對BSA圓二色光譜的影響圖.由圖7得知，BSA在208 nm和222 nm處有兩個明顯的特征負峰，這是典型的α-螺旋結構[15].加入化合物后，譜圖的形狀和峰位沒有發(fā)生顯著的變化，但峰強度減弱.這說明化合物的加入對BSA產生了影響，導致BSA的構象發(fā)生了變化.我們可通過公式⑸求出α-螺旋值[16]

α%=[(-[θ]280-4 000)/(33 000-4 000)]×100% ，

(5)

MRE280=CD/10cpnl，

(6)

圖7 希夫堿化合物對BSA作用的圓二色光譜圖[ BSA]=4.5× 10-7 mol·L-1, [希夫堿]=1.0 ×10-5 mol·L-1.

式中cp是BSA的摩爾濃度，n是氨基酸殘基數(BSA為583)，l是路徑長度(1 cm).計算得BSA的α-螺旋值含量在加入化合物后從原來47.6%降到41.4%，說明希夫堿化合物與BSA的相互作用使BSA的二級結構產生了影響.原因可能是希夫堿化合物通過氫鍵等作用與α-螺旋的氨基酸殘基發(fā)生相互作用，從而改變了α-螺旋結構，導致BSA中的α-螺旋量降低.

2.3 抗菌實驗

初步體外抑菌實驗結果說明該希夫堿化合物對大腸桿菌E.coliBL21(DE3)有較好的抑菌活性，其平均抑菌圈直徑約為15 mm.對于其它菌落的抑菌活性需要進一步的研究，希望能為探索高效低毒的抗菌藥物提供一定的參考.

3 結論

合成了水楊醛縮乙二胺希夫堿化合物，利用紫外可見吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜法研究了水楊醛縮乙二胺希夫堿與BSA的相互作用.結果表明，該希夫堿化合物與BSA形成1∶1的復合物，使BSA的內源性熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，導致BSA的α-螺旋含量減少.體外抑菌實驗表明該希夫堿對大腸桿菌具有一定的抑菌活性.這些結果為探討希夫堿化合物與BSA相互作用的分子機理提供了有用的信息.

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Synthesis，BSA Interactions and Antibacterial Properties of Schiff Base of N,N-Ethylenebis(salicylideneimine)

PANG Xu-liang ZHAO Pei-ran Dong Jian-fang YE Xin-hui LI Lian-zhi

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

A Schiff base compound, N,N-ethylenebis(salicylideneimine), has been synthesized. The interaction of the compound with bovine serium albumin(BSA) was studied by UV-Vis absorption, fluorescence and circular dichroism spectroscopies. The results indicate that the Schiff base and BSA formed a complex, thus leading a conformational change of BSA and quenching BSA’s intrinsic fluorescence. The thermodynamic parameters of their interaction were calculated. The result of ntibacterial experiment of the Schiff base onE.coliin vitro showed that it has a good antibacterial activity.

N,N-ethylenebis(salicylideneimine), bovine serium albumin, spectroscopy, antibacterial activity

2017-03-20

山東省自然科學基金項目(Y2004B02)；聊城大學大學生科技文化創(chuàng)新基金(26312160514)資助

李連之,E-mail:lilianzhi1963.@163.com

O626

A

1672-6634(2017)02-0045-05