陳　莉

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 揚州, 225001)

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的前5位[1]。根據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告[2], 每千人新增癌癥患者中就有679人被診斷為胃癌，每千人癌癥死亡患者中有498例死于胃癌。晚期胃癌預(yù)后差, 5年生存率不足10%。目前外科手術(shù)切除是胃癌主要的根治手段，而對Ⅳ期及非根治術(shù)、術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的晚期患者而言，化療是主要的治療方法。目前臨床上仍存在部分患者不能從化療中受益，無法早期判斷化療療效。MACC1是由Stein等[3]對結(jié)腸黏膜、結(jié)腸癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶通過差異分析基因表達時發(fā)現(xiàn)的，其與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且高表達可以誘導(dǎo)腫瘤細胞體外增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。除了發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用外, MACC1還與腫瘤的糖代謝有關(guān)。Lin L等[4]研究發(fā)現(xiàn), MACC1可增強胃癌細胞的葡萄糖無氧酵解過程(warburg效應(yīng))，并且在各種應(yīng)激因子(代謝應(yīng)激、化療、放療等)作用下，反應(yīng)性增高，增高后的MACC1可通過促進warburg效應(yīng)抗凋亡促增殖。因此，血清MACC1有可能作為胃癌臨床化療療效早期預(yù)測的有效指標(biāo)[5]。本研究探討MACC1 在胃癌患者對5-Fu為基礎(chǔ)的化療耐藥中的作用及其與化療療效的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1　材料與試劑

人胃癌細胞系BGC-823、MACC1 ELISA試劑盒、RMPI-1640 培養(yǎng)基、胰酶、嘌呤霉素等購于武漢庫克金生物科技有限公司，胎牛血清購于武漢柏能達科生物科技有限公司，采購SYBR, 含MACC1過表達和干擾的重組慢病毒顆粒, MACC1和GAPDH上下游引物。

1.2　臨床資料

選取2016年1月—2017年4月本院診治的40例晚期胃癌初治患者治療前血清樣本。所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷為胃腺癌。入院常規(guī)檢查包括血常規(guī)、肝腎功能、腹部CT等。其中男28例，女12例，平均年齡(53.0±6.58)歲?；煼桨笧橐?-氟尿嘧啶(5-Fu)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，化療周期為4～6周。

1.3　細胞培養(yǎng)與穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建

人胃癌細胞株BCG-823常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合至90%, 即對數(shù)生長期時胰酶消化，取2 mL接種于六孔板中，細胞密度為2×105個/孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度達50% 時，用含過表達(pLV-Puro-MACC1)和干擾(pLVshRNA-Puro-MACC1) MACC1的慢病毒顆粒分別感染BCG-823細胞，感染48 h后用含嘌呤的培養(yǎng)基進行篩選，濃度為0.5 μg/mL, 每2天更換一次培養(yǎng)基，設(shè)置正常BCG-823細胞為對照組，第5天撤去藥物，得到過表達MACC1細胞株pLV-MACC1/BCG-823和干擾MACC1細胞株pLVsh-MACC1/BCG-823, 擴增細胞用于實驗。

1.4　RT-PCR檢測細胞中MACC1的mRNA表達 水平

Trizol法提取對照組(BCG-823), 過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的胃癌細胞總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 以得到的cDNA為模板進行熒光定量PCR實驗，以GAPDH為內(nèi)參。MACC1上游引物序列為5＇-ATCCGCCACACATGCTTAA-3＇, 下游引物序列為5＇-CTTCAGCCCCAATTTTCATC-3＇, GAPDH上游引物序列為5＇-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3＇, 下游引物序列為5＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇。反應(yīng)體系如下: SYBR Premix Ex Taq(2x)10 μL, 基因上游引物(10μmol/L) 0.5 μL, 下游引物(10μmol/L) 0.5 μL, 模板1 μL, ddH2O補足至20 μL; 反應(yīng)條件為: 95 ℃變性30 s, 95 ℃ 5 min, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 重復(fù)40個循環(huán)。每組樣本設(shè)置3個復(fù)孔，將同一樣本中目的基因的Ct值減去GAPDH的Ct值，得到目的基因的△Ct值。2(-△Ct)即為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達量。

1.5　通過ELISA法測定細胞培養(yǎng)液、胃癌病人 血清中MACC1蛋白表達水平

待對照組(BCG-823), 過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的細胞生長至80%～90%時，小心收集各組細胞上清液，低溫離心后-80 ℃保存; 用血清分離管抽取胃癌患者外周血5 mL, 室內(nèi)凝結(jié)30 min后, 1 000×g低溫離心15 min, 取上清-80 ℃保存。按照 ELISA試劑盒說明書檢測MACC1蛋白表達水平，具體為: 將不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品和空白對照各100 μL加到包被MACC1抗體的96空板上37 ℃孵育2 h, 吸凈每孔，然后用洗滌緩沖液洗滌3次。然后每孔加100 μL抗體檢測液, 37 ℃孵化2 h。吸干每個孔，洗滌緩沖液洗滌3次，每孔加入100 μL的檢測試劑A, 37 ℃孵育2 h, 再次洗滌后，每孔加入100 μL的底物稀釋液, 37℃避光孵育15 min后每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。輕輕拍打混勻后, 30 min內(nèi)上機檢測，在450 nm處讀取每個孔OD值，同時設(shè)調(diào)零孔。所有實驗設(shè)置6個復(fù)孔。

1.6　MTT 法檢測細胞對5-Fu的敏感性

收集處于對數(shù)生長期的對照組(BCG-823), 過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細胞鋪96孔板，每孔加入100 μL, 細胞密度為9 000個/孔，過夜培養(yǎng)后棄去上清，加入不同濃度的5-Fu, 設(shè)7個濃度梯度，分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL, 每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)終止培養(yǎng)，繼續(xù)孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min, 使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm處檢測各孔的吸光度OD值，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。

1.7　化療療效評定

根據(jù)治療前后胃癌患者影像學(xué)資料(增強CT)評價化療療效，采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1[6]。完全緩解(CR): 所有靶病灶消失，全部病例淋巴結(jié)(包括靶結(jié)節(jié)和非靶結(jié)節(jié))短徑必須減少至<10 cm; 部分緩解(PR): 靶病灶直徑之和比基線水平減少至少30%; 疾病進展(PD): 靶病灶直徑之和相對增加至少20%; 疾病穩(wěn)定(SD): 靶病灶減小或增加的程度介于PR和PD。疾病控制率(DCR)= CR+PR+SD。

1.8　統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析( One-way ANOVA), 檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　生存分析

作者在KM plotter數(shù)據(jù)庫[7-8]中分析發(fā)現(xiàn), MACC1的表達量和預(yù)后呈明顯負相關(guān)，在mRNA水平上, MACC1低表達的患者的總生存時間顯著高于MACC1高表達患者(P<0.05), 見圖1。同時分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中MACC1在不同期別病人中的表達量的差異[9], 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在不同期別病人中的表達量存在差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與正常組織相比, MACC1的表達量存在顯著差異(P<0.05), 見圖2。

2.2　RT-PCR法檢測細胞中MACC1的mRNA 表達水平

RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組(BCG-823)相比，過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)細胞中mRNA水平顯著上調(diào)，干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細胞的MACC1 mRNA表達水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 基于KMplotter數(shù)據(jù)庫的胃癌患者生存曲線

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中MACC1在不同期別病人中的表達量的差異

圖3 RT-PCR法檢測細胞中MACC1的mRNA表達水平

2.3　ELISA法檢測細胞株培養(yǎng)液中MACC1蛋白 表達水平

ELISA檢測對照組(BCG-823)、過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細胞培養(yǎng)液中MACC1水平，過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)細胞培養(yǎng)液中MACC1蛋白水平較其他兩組明顯升高，而干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細胞培養(yǎng)液中的MCCC1蛋白水平明顯降低，低于對照組和過表達組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 與細胞中MACC1 mRNA水平呈正相關(guān)。見圖4。

圖4 ELISA法檢測細胞株培養(yǎng)液中MACC1蛋白表達水平

2.4　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各組細胞對順鉑敏感性影響

加入不同濃度的5-Fu藥物作用48 h后發(fā)現(xiàn)，對照組(BCG-823), 過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的細胞存活分數(shù)隨著藥物濃度的增加而減少，且三組細胞對5-Fu的敏感性存在差異。過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)細胞對5-Fu的敏感性最差，當(dāng)干擾MACC1后, BCG-823細胞對5-Fu的敏感性增加，細胞存活率降低。5-Fu藥物濃度越大，其抑制干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細胞增殖作用越明顯，高于對照組(BCG-823)和過表達組(pLV-MACC1/BCG-823), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 不同5-Fu濃度下細胞存活分數(shù)的差異

2.5　療效評價

根據(jù)增強CT進行臨床化療療效評價，結(jié)果顯示，臨床上晚期胃癌患者對以5-Fu為基礎(chǔ)的化療療效存在差異。療效評價為PR和PD的2例患者CT結(jié)果顯示患者行胃癌根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，予以化療?；熐?，患者門靜脈主干栓子形成和肝臟轉(zhuǎn)移，化療后可見門靜脈海綿樣變性，肝臟轉(zhuǎn)移灶變小，化療療效好。而診斷為初治胃癌肺轉(zhuǎn)移患者化療后肺轉(zhuǎn)移病灶無明顯變化，胃原發(fā)病灶進展，化療療效差。

2.6　ELISA法檢測患者血清中MACC1蛋白表達 水平

ELISA法檢測不同胃癌患者治療前血清中MACC1蛋白含量，作者發(fā)現(xiàn)不同患者的血清樣本中的MACC1水平存在差異。結(jié)合化療后影像學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療前血清MACC1含量低的患者對以5-Fu為基礎(chǔ)的化療效果較好，而MACC1含量高的患者的化療療效較差，見表1。

表1　晚期胃癌患者化療前血清 MACC1

與疾病進展組相比, *P<0.01。

3　討　論

目前，胃癌是全世界常見的致死性腫瘤之一，每年約有70萬人死于胃癌，尤其在亞洲東部國家[10]。在中國，每年就有超過40萬人被診斷為胃癌，死亡人數(shù)超過新發(fā)病例的一半。胃鏡在臨床上的普遍使用使得胃癌的早期診斷率有了很大的提高，但是大部分患者在診斷時已是晚期，中位生存期不超過一年[11-12], 且胃鏡屬于侵入性檢查，其作為常規(guī)檢查手段不為大部分患者所接受，因此在西方國家，仍有80%診斷為胃癌的患者臨床分期為Ⅳ期[13]。目前胃癌的主要治療手段為手術(shù)治療，輔以化療或放療，但治療后仍有很高的腫瘤復(fù)發(fā)率和遠處轉(zhuǎn)移率。臨床癥狀復(fù)發(fā)，診斷較晚期，缺乏個體化精準(zhǔn)治療的評估策略使得胃癌的死亡率居高不下[14]。遺傳病因?qū)W，組織學(xué)等分子特征的差異導(dǎo)致胃癌患者對化療敏感性存在較大差異[15], 晚期患者化療或靶向治療后的五年生存率不超過5%。因此，尋找能夠預(yù)測化療療效的高效應(yīng)、低損傷的生物標(biāo)記物就顯得尤為迫切。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(MACC1)功能的發(fā)揮主要依賴于SH3結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)合位點，這兩種結(jié)構(gòu)對下游c-Met的激活十分關(guān)鍵[16], 此外, MACC-1羧基端兩個死亡結(jié)構(gòu)域調(diào)控炎癥、凋亡以及侵襲等生物學(xué)過程[17]。最初MACC1的研究局限于其對結(jié)腸癌侵襲遷移的作用，近年來MACC1也被發(fā)現(xiàn)在肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤以及卵巢癌等腫瘤組織中高表達，與患者不良預(yù)后相關(guān)[18-25], 可以預(yù)測患者的預(yù)后。Wang L等[26]報道MACC1在胃癌的表達水平高于正常組織，并發(fā)揮促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，控細胞周期的作用。目前有關(guān)MACC1對腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究很廣泛，但主要集中在組織及細胞水平，急需尋找一種即時、便捷、無創(chuàng)的方式檢測MACC1的表達進而早期預(yù)測胃癌患者化療療效及預(yù)后。

本研究構(gòu)建MACC1過表達、低表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系pLV-MACC1/BCG-823和pLVsh-MACC1/BCG-823, 檢測細胞中MACC1 mRNA水平確認穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建成功并比較不同細胞內(nèi)MACC1 mRNA的差異。檢測細胞上清中MACC1蛋白含量并與mRNA水平對比，并比較不同細胞分泌的MACC1含量的差異。過表達組(pLV-MACC1/BCG-823)細胞分泌的MACC1蛋白水平明顯高于干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)和對照組(BCG-823), 并且和細胞內(nèi)MACC1 mRNA表達趨勢一致，證明胃癌細胞分泌的MACC1蛋白水平與細胞中MACC1水平呈正相關(guān)，這為通過檢測血清MACC1水平了解胃癌惡性生物學(xué)行為奠定了細胞學(xué)基礎(chǔ)。通過MTT實驗作者發(fā)現(xiàn)，三種細胞株對5-Fu敏感性存在差異。當(dāng)干擾MACC1后, BCG-823細胞對5-Fu敏感性增加，細胞存活率降低，上調(diào)MACC1后, BCG-823對5-Fu的敏感性降低。通過檢測40例晚期胃癌患者治療前血清中MACC1水平發(fā)現(xiàn)，化療前不同患者血清中的MACC1含量存在差異。通過影像學(xué)資料對比分析發(fā)現(xiàn)，化療前MACC1含量低的患者化療療效優(yōu)于MACC1含量高的患者，這提示MACC1可以先于CT預(yù)測胃癌患者對以5-Fu為基礎(chǔ)的化療療效。因此，血清MACC1有可能作為胃癌臨床化療療效早期預(yù)測的有效指標(biāo)。

Stein等[27]通過檢測結(jié)直腸癌患者血液中循環(huán)MACC1的mRNA水平來預(yù)測高危結(jié)腸癌病人。Wang G等[25]通過檢測胰腺癌病人血清中的MACC1含量發(fā)現(xiàn)其具有促進腫瘤細胞耐藥作用，但有關(guān)胃癌血清中MACC1的表達水平與化療耐藥、病人預(yù)后的關(guān)系未見報道。本文通過過表達、干擾MACC1測定胃癌細胞株對5-Fu耐藥的影響，通過檢測血清中MACC1含量，闡明血清MACC1水平是胃癌化療療效評價的即時、便捷、無創(chuàng)的生物標(biāo)志物，將為尋求新的胃癌化療療效預(yù)測指標(biāo)提供新的實驗依據(jù)。

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