萬(wàn)麗麗　 王轉(zhuǎn)茸　　辛　強(qiáng)　 董發(fā)明　　洪登峰　 楊光圣 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 湖北武漢 430065; 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070

分子伴侶能夠幫助蛋白質(zhì)正確地折疊或者遷移,從而起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的功能[1]。很多分子伴侶是熱激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)成員。HSP70是熱激蛋白研究中最深入的家族, 它們普遍存在于高等植物的胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體和線粒體中[2]。HSP70參與新生肽的成熟與分揀, 分泌蛋白向細(xì)胞器或者胞外的轉(zhuǎn)運(yùn), 并能恢復(fù)或清除細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)變性的蛋白質(zhì), 從而保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定, 對(duì)生物體起到重要作用[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是所有真核生物細(xì)胞中分泌蛋白合成中心, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)控系統(tǒng)控制著分泌蛋白的加工、折疊和定位, 引導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)降解, 最終保證只有正確折疊的蛋白在分泌途徑中行使功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)控系統(tǒng)主要由分子伴侶來(lái)完成, 這類分子伴侶被稱為結(jié)合蛋白(binding protein, BiP), 其主要功能是幫助分泌蛋白正確折疊組裝成為具有活性的空間結(jié)構(gòu), 轉(zhuǎn)運(yùn)分泌蛋白到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的網(wǎng)腔, 后引導(dǎo)其降解[5]。

前人研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)植株遭受干旱脅迫時(shí), 水分大量而長(zhǎng)久的缺失會(huì)破壞植物細(xì)胞穩(wěn)態(tài), 導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)積累在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中, 被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(ER stress)[6-10]。應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫, 細(xì)胞會(huì)激活具有保護(hù)自身功能的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng), 即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR), 誘導(dǎo)分子伴侶的富集和參與分泌降解途徑發(fā)生, 促進(jìn)逆境脅迫下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊和加工能力。分子伴侶結(jié)合蛋白通過(guò)識(shí)別和定位異常折疊蛋白后直接參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑。UPR的發(fā)生分為兩種途徑, 一是IRE1-like介導(dǎo)的位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分子伴侶的上調(diào)表達(dá); 二是ATF6-like介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)[9]。前人研究結(jié)果表明, 在逆境下植物的分子伴侶結(jié)合蛋白參與調(diào)控UPR途徑[11-13]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到脅迫后, 細(xì)胞中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生交流, 傳遞脅迫信號(hào), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的特異基因啟動(dòng)相關(guān)途徑及時(shí)處理異常蛋白質(zhì), 最終恢復(fù)細(xì)胞正常的分泌蛋白活性[3,14-16]。在煙草原生質(zhì)體中, 超表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)激相關(guān)分子伴侶結(jié)合蛋白能夠協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊, 反之, 當(dāng)這類分子伴侶的表達(dá)受到抑制, 會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)脅迫后氧化還原反應(yīng)的敏感性; 在煙草中, 超表達(dá)分子伴侶結(jié)合蛋白, 能夠增強(qiáng)對(duì)干旱脅迫的抗性; 在大豆中, 4個(gè)BiP基因受到逆境處理誘導(dǎo)表達(dá), 當(dāng)超表達(dá)4個(gè)基因時(shí), 能夠降低干旱和滲透脅迫后葉片的失水速率, 提高對(duì)逆境的耐受性[17-18]。此外, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)基因超表達(dá)能夠增強(qiáng)植物種子萌發(fā)時(shí)對(duì)糖基化酶抑制劑衣霉素處理的耐受性, 并提高幼苗的存活率[7,17]。施加衣霉素等同于增加細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫, 為了獲得細(xì)胞的穩(wěn)態(tài), 超表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的分子伴侶能夠迅速協(xié)助脅迫條件下異常蛋白質(zhì)的正常折疊或者降解, 在這個(gè)過(guò)程中, UPR途徑被激活, 提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理異常蛋白質(zhì)的能力, 平衡細(xì)胞分泌的活性。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脅迫反應(yīng)持久存在, 會(huì)進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡的途徑。在擬南芥中, 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有關(guān)的 Gβ-Gγ的異源二聚體蛋白質(zhì)參與的信號(hào)途徑能夠激發(fā)UPR有關(guān)的細(xì)胞死亡; 在大豆中, 分子伴侶所誘導(dǎo)的 UPR途徑中, 存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(PCD)信號(hào)途徑, 這個(gè)途徑能夠整合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和滲透脅迫的信號(hào), 增強(qiáng)脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控基因N-rich蛋白質(zhì)和含有 NAC結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)GmNAC6的表達(dá)。N-rich蛋白質(zhì)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)能夠通過(guò)長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和滲透調(diào)節(jié)脅迫傳遞 PCD信號(hào)。

在豌豆中BiP基因受到水分、真菌侵染、昆蟲(chóng)啃食等外界脅迫環(huán)境上調(diào)表達(dá)[19]; 在高溫、干旱等逆境脅迫條件下, 菠菜中 BiP蛋白會(huì)逐漸增加[20];水稻中BiP3基因所編碼的蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)XA21蛋白的加工來(lái)實(shí)現(xiàn)植株對(duì)白葉枯病的抗性[21]。從玉米抗旱自交系旱 21中分離得到的逆境脅迫的負(fù)調(diào)控因子ZmBiP2超表達(dá)后增加了擬南芥轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和甘露醇脅迫的敏感性, 而 HSP70可以提高干旱高溫復(fù)合脅迫誘導(dǎo)下玉米葉片抗氧化防護(hù)能力[22]。對(duì)耐熱葉用萵苣品種在高溫脅迫下的分析發(fā)現(xiàn),HSP70-3701基因在處理中保持較高的表達(dá)水平可能與耐熱性相關(guān)[23]。大豆和煙草中超表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的分子伴侶結(jié)合蛋白BiP基因能夠顯著增強(qiáng)逆境脅迫。綜上所述, 超表達(dá)BiP基因能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫以及滲透脅迫所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡, 從而維持細(xì)胞在逆境下的穩(wěn)態(tài)。由于BiP基因的序列和功能在不同植物中具有保守性, 這為其他植物的抗旱研究提供了有利的基因資源。本研究克隆了與植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的分子伴侶BiP基因同源的基因BnA7HSP70, 超表達(dá)BnA7HSP70基因的油菜在缺水、滲透脅迫以及衣霉素處理后表現(xiàn)較強(qiáng)的耐受性。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

選用甘藍(lán)型油菜自交系7492由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楊光圣教授團(tuán)隊(duì)提供。

1.2　甘藍(lán)型油菜的BnA7HSP70基因的克隆與轉(zhuǎn)化

依據(jù)大豆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)基因BiPD(AF031241)的序列, 從甘藍(lán)型油菜自交系7492中克隆出其同源基因BnA7HSP70(GenBank登錄號(hào)為KP091457)。將2.01 kb的BnA7HSP70基因通過(guò)酶切連接插入到植物雙元轉(zhuǎn)化表達(dá)載體 PBI 121中, 通過(guò)農(nóng)桿菌 GV 3101介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜中。

1.3　BnA7HSP70蛋白亞細(xì)胞定位

將BnA7HSP70基因克隆到PGY-EGFP亞細(xì)胞定位專用載體中, 利用 QIAGEN Plasmid Midi Kit(http：//www.qiagen.com/)試劑盒提取高質(zhì)量質(zhì)粒DNA, 利用PEG-Ca2+介導(dǎo)的方法將亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞。在Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP在細(xì)胞內(nèi)的定位狀況。

1.4　植物的生長(zhǎng)、水分脅迫和衣霉素處理

將非轉(zhuǎn)基因植物(WT)和35S啟動(dòng)子作用下的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系(OE)種植在溫室中。用于水分脅迫處理的轉(zhuǎn)基因家系是通過(guò)鑒定后選擇的1個(gè)純合家系。水分脅迫實(shí)驗(yàn)在可控制的環(huán)境下進(jìn)行, 油菜在白天25℃ 14 h和黑暗22℃ 10 h的環(huán)境下種植, 光照為240 μmol m-2s-1, 相對(duì)濕度為60%～70%。經(jīng)過(guò)4周正常生長(zhǎng)后, 對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料實(shí)施 10 d的缺水處理。滲透脅迫實(shí)驗(yàn)中是將生長(zhǎng)40 d的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)移到20% PEG (MW-6000)的液體培養(yǎng)基中處理 48 h。在衣霉素處理實(shí)驗(yàn)中, 采用2.5～10.0 μg mL-1衣霉素加入到油菜發(fā)芽(murashige and skoog, MS)培養(yǎng)基或者將三葉期正常生長(zhǎng)的油菜苗轉(zhuǎn)移到一定濃度衣霉素含量的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)。將脅迫實(shí)驗(yàn)不同階段收獲的葉片迅速冷凍于-80℃儲(chǔ)存。設(shè)置各實(shí)驗(yàn)處理3次重復(fù), 每次重復(fù)選用5個(gè)單株。

1.5　抗旱脅迫中的生理生化指標(biāo)

抗旱脅迫實(shí)驗(yàn)中所選用的是轉(zhuǎn)基因純合家系的植株, 選用每個(gè)處理3～5個(gè)單株混合葉片6～8片, 每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.5.1丙二醛測(cè)定用 20% PEG處理后的植株葉片的丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)脂過(guò)氧化反應(yīng)。利用硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid, TBA)反應(yīng)測(cè)定MDA的含量。通過(guò)測(cè)定532、 600和450 nm下葉片提取物上清中的吸光度值來(lái)計(jì)算MDA的含量。MDA (μmol L-1) =6.45× (D532-D600) - 0.56×D450。

1.5.2超氧化物歧化酶測(cè)定取1 g 20% PEG處理植株的葉片, 用3 mL 200 mmol L-1磷酸緩沖液(2 mmol L-1磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、2 mmol L-1EDTA和80 mmol L-1抗壞血酸維生素C, pH 7.8) 10 000×g離心25 min后, 通過(guò)Bradford法定量蛋白質(zhì)?？偝趸锲缁?superoxide dismutase, SOD)的活性是通過(guò) 560 nm波長(zhǎng)下與硝基藍(lán)四氮唑(nitroblue tetrazolium, NBT)的顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定, 反應(yīng)體系包含50 mmol L-1磷酸鈉(pH 7.8)、13 mmol L-1甲硫氨酸、2 μmol L-1維生素 B2、0.1 μmol L-1EDTA 和 75μmol L-1NBT。單位酶活力定義為能夠抑制NBT反應(yīng)活力 50%所使用的酶量。利用鄰苯三酚為底物測(cè)定過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性。1個(gè)單位的POD活性定義為在20 s中從鄰苯三酚中獲得1 mg紅棓酚的酶活力, 測(cè)定波長(zhǎng)為420 nm。

1.5.3植物相對(duì)含水量(relative water content, RWC)和葉綠素含量測(cè)定在干旱處理下, 油菜葉片的相對(duì)含水量RWC (%) = (鮮重-干重)/(飽和水葉片重量-干重)×100。用打孔器從每片葉子的不同位置截取直徑為1 cm葉盤(pán), 設(shè)3個(gè)重復(fù), 將葉盤(pán)混合后在1 mL 80%丙酮中研磨, 將抽提物以 100%丙酮稀釋10倍后, 在A645和A663波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。葉綠素a(μg mL-1) = 12.5A663-2.55A646; 葉綠素b(μg mL-1) = 18.29A646-4.58A663。

1.5.4Evans Blue染色分析用土缽種植油菜苗在正常灌溉條件下生長(zhǎng)4周后斷水10后取4片葉盤(pán)置0.25% (w/v) Evans blue溶液中, 100 r min-1震蕩20～30 min。將葉盤(pán)取出在ddH2O中清洗至無(wú)藍(lán)色液體從細(xì)胞中滲透出來(lái), 之后在 96%乙醇溶液中浸泡以除去葉綠素。通過(guò)葉片上藍(lán)色染色狀態(tài)確定死亡的細(xì)胞。將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中, 加0.5 mL ddH2O用細(xì)研棒研磨, 以10 000×g離心5 min, 結(jié)束后加入50% (v/v)乙醇和1% (w/v) SDS溶液在60℃處理30 min。最后在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度值。

1.5.5Real-time PCR分析提取油菜葉片 RNA(RNeasy Plant MiniKit, Promega), 用NanoDrop 2000(Thermo Fisher, 美國(guó))分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度。取樣品RNA 1 μg, 進(jìn)行First-Strand cDNA Synthesis反應(yīng)。取稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL, 在 CFX96 Real-time system (Bio-Rad)中進(jìn)行 PCR反應(yīng), 參照GoTaqqPCR Master Mix (Promega, 美國(guó))的操作來(lái)配制qRT-PCR體系, 設(shè)每個(gè)樣品3次重復(fù)。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 60℃復(fù)性30 s,72℃延伸15 s, 45個(gè)循環(huán); 95℃, 10 s; 65℃至95℃, 5 s。依照 2-ΔΔCt方法計(jì)算 qRT-PCR 結(jié)果[24]。

2　結(jié)果與分析

2.1　油菜BnA7HSP70基因的蛋白質(zhì)表達(dá)分析

將BnA7HSP70基因的編碼區(qū)在CaMV 35S啟動(dòng)子作用下與GFP蛋白融合, 用所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位, 發(fā)現(xiàn)融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。

圖1　BnA7HSP70-GFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的定位Fig. 1　Subcellular localization of BnA7HSP70 and GFP fusion protein in Arabidopsis protoplasts.(A) BnA7HSP70和GFP融合后蛋白的亞細(xì)胞定位, 在488 nm下原生質(zhì)體中細(xì)胞質(zhì)顯示綠色熒光; (B)在580 nm下同樣原生質(zhì)體中葉肉細(xì)胞顯示紅色熒光信號(hào); (C)自然光照視野下細(xì)胞圖; (D)自然光和熒光下的融合圖片。(A) Subcellular localization of full-length GFP fused with green fluorescent protein (GFP), the cytoplasm showed a green fluorescent signal at 488 nm. (B) The mesophyll cells showed a red fluorescent signal at 580 nm. (C) A bright-field image of protoplast cell;(D) A bright-field image and the merged image are shown at the bottom. Scale bars, 10 μm.

2.2　BnA7HSP70超表達(dá)植株在干旱條件下表現(xiàn)出耐旱性

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株種植在溫室中, 待生長(zhǎng)到四至五葉期開(kāi)始連續(xù)斷水10 d。對(duì)照材料的葉片完全萎蔫, 而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫的耐受性。復(fù)水3 d后, 對(duì)照材料不能繼續(xù)生長(zhǎng), 直至死亡。而大多數(shù)的超表達(dá)植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng),葉片相對(duì)含水量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?圖 2-A～C,F)。另外, 將在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因超表達(dá)植株生長(zhǎng) 40 d后, 轉(zhuǎn)移到 20% (w/v)PEG-6000溶液中進(jìn)行滲透脅迫處理48 h。超表達(dá)植株在滲透脅迫處理后葉片相對(duì)含水量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖2-D～E, G)。總結(jié)上述實(shí)驗(yàn)：BnA7HSP70超表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性。

2.3　干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株的生理生化指標(biāo)分析

當(dāng)植物遇到干旱后光合作用發(fā)生紊亂, 光呼吸作用增強(qiáng), 呼吸速率上升, 葉綠體和線粒體中積累大量過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的一種,大量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。除此以外, 自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化程度反映了干旱處理對(duì)植物細(xì)胞的脅迫程度。轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的20% PEG處理結(jié)果顯示, 野生型植株的H2O2含量高于轉(zhuǎn)基因植株(圖3-A)。干旱脅迫導(dǎo)致的活性氧爆發(fā)會(huì)使得植物葉片衰老, 植株中丙二醛含量是衡量植株對(duì)逆境脅迫的耐受性指標(biāo)。20% PEG處理后植株葉片中脂質(zhì)過(guò)氧化程度在處理后第 3天會(huì)增加, 轉(zhuǎn)基因植株葉片中丙二醛的含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株, 表明轉(zhuǎn)化BnA7HSP70基因能夠提高油菜苗期逆境下抗過(guò)氧化能力(圖3-B)。

2.4　轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的抗氧化相關(guān)酶活性測(cè)定

干旱脅迫會(huì)使得植株產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng), 導(dǎo)致抗氧化相關(guān)酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的變化。在正常條件下, 非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植株SOD活性差異不顯著, 干旱脅迫處理后轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株中SOD活性增加, 但是前者顯著高于后者(圖4-A)。同樣, 在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中POD的含量也顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。SOD和POD酶活力的增加能夠清除氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)植株本身的傷害, 降低對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的損傷(圖4-B)。

2.5　干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉片相對(duì)含水量的變化以及衰老相關(guān)基因的表達(dá)分析

將正常灌溉條件下生長(zhǎng)到六至八葉期的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株斷水處理10 d后, 在4個(gè)轉(zhuǎn)基因家系OE2、OE3、OE7和OE8中葉片的相對(duì)含水量為58%、62%、71%和55%, 高于非轉(zhuǎn)基因植株44%的相對(duì)含水量(圖5-A)。在繼續(xù)7 d干旱后, 非轉(zhuǎn)基因植株的葉片中葉綠素含量比轉(zhuǎn)基因植株顯著下降(圖 5-B)。

圖2　BnA7HSP70基因超表達(dá)植株(OE)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?WT)在干旱和20% PEG滲透脅迫處理后表現(xiàn)出耐旱性Fig. 2　BnA7HSP70 overexpressed (OE) plants confer tolerance under a restricted water regime and 20% PEG treatment(A)對(duì)生長(zhǎng)4～5周油菜苗進(jìn)行斷水10 d處理, 可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更好的耐受性; (B)對(duì)生長(zhǎng)4～5周油菜苗進(jìn)行斷水15 d處理, 可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更好的耐受性; (C)干旱10 d后復(fù)水3 d, 大多數(shù)非轉(zhuǎn)基因植株不能恢復(fù)正常生長(zhǎng), 而轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)。(D)在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)40 d的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植株; (E)將生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)液中40 d的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)移到20% (w/v) PEG-6000的培養(yǎng)液中48 h。通過(guò)處理過(guò)程中每天更換新鮮的PEG溶液來(lái)保證處理時(shí)的濃度保持不變; (F)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株在干旱10 d、15 d和復(fù)水3 d后葉片的相對(duì)含水量測(cè)定; (G)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株從營(yíng)養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到20% PEG-6000滲透脅迫處理48 h后葉片的相對(duì)含水量。(A) For the fast soil drying treatment, wild type (WT) and BnA7HSP70 overexpressed (OE) lines were allowed to reach four to five weeks leaves stage of development when drought was rapidly induced by withholding irrigation for 10 days. The stress condition was prolonged until the leaves of wild type plants completely wilted. (B) For the fast soil drying treatment, wild type (WT) and BnA7HSP70 overexpressed(OE) lines were allowed to reach four to five weeks leaves stage of development when drought was rapidly induced by withholding irrigation for 15 days. The stress condition was prolonged until the leaves of wild type plants completely wilted. (C) After rewatering for 3 days, most wild type plants were unable to recover, while OE plants survived continued to grow. (D) 40-day-old WT and OE transgenic plants grown in nutrient solution. (E) For drought stress, 40-day-old WT and OE transgenic plants were transferred into nutrient solution containing 20% (w/v)PEG-6000 for 48 h. The concentration of PEG was maintained daily by changing the nutrient solution. (F) Leaf relative water content from WT and OE plants after 10 days, 15 days drought stress and 3 days rewater treatment. (G) Leaf relative water content from WT and OE plants after 20% PEG-6000 treatment for 48 h.

當(dāng)植物遇到干旱脅迫時(shí), 形態(tài)上、生理上以及分子生物學(xué)水平會(huì)發(fā)生變化, 如植株葉片會(huì)提前衰老來(lái)加速營(yíng)養(yǎng)從老葉向幼葉轉(zhuǎn)化, 最終保證自身的存活[26-27]。為探索BnA7HSP70基因超表達(dá)是否與葉片衰老相關(guān), 在甘藍(lán)型油菜中取距離心葉第 3片葉, 檢測(cè)葉片衰老標(biāo)識(shí)基因BnLSC54和BnLSC222基因的表達(dá)量。在正常灌溉條件下, 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的葉片中BnLSC54和BnLSC222基因的表達(dá)量較低, 而在干旱條件下,BnLSC54和BnLSC222基因受到誘導(dǎo)表達(dá), 并且在非轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)量高于轉(zhuǎn)基因植株(圖6)。干旱脅迫能夠顯著提高油菜葉片衰老相關(guān)基因的表達(dá), 從而表現(xiàn)出葉片快速變黃, 而在超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因家系中, 葉片衰老相關(guān)基因的表達(dá)量存在一定程度的提高, 但比非轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量增加的程度要低。

圖3　20% PEG處理下轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株中的H2O2和MDA含量Fig. 3　Changes of H2O2 content and MDA levels in wild plant and transgenic plant line under 20% PEG treatment.(A) 20% PEG處理后第3天植株H2O2含量; (B) 20% PEG處理后第3天植株中MDA含量。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(A) H2O2 content of seedlings at these days of the 20% PEG treatment; (B) MDA levels of seedlings at these days of the 20% PEG treatment. Data are shown as mean±SD of three independent measurements.

圖4　20% PEG脅迫條件下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性Fig. 4　Antioxidant enzyme activities in wild plant and transgenic plants after treatment with 20% PEG(A) SOD酶活性; (B) POD酶活性。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(A) SOD activity; (B) POD activity. Data are shown as means ±SD of three independent measurements.

圖5　超表達(dá)BnA7HSP70轉(zhuǎn)基因油菜能夠在斷水10 d后具有較高持水能力Fig. 5　Overexpression of BnA7HSP70 makes Brassica napus hold more water in soil pot without irrigation for 10 days(A)轉(zhuǎn)基因植株(OE2、OE3、OE7和OE8)與非轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的相對(duì)含水量; (B)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料每個(gè)家系取樣6～8片葉子, 測(cè)定葉綠素含量。Control： 正常生長(zhǎng)條件下的野生型和超表達(dá)植株; Stress： 生長(zhǎng)到4周的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行連續(xù)7 d干旱處理。(A) Relative water content (RWC) of wild type and BnA7HSP70 overexpressing seedling (OE2, OE3, OE7, and OE8) leaves under drought condition. (B) Chlorophyll a and b concentrations were calculated as described in the materials and methods 1.5.3 and combined to give the total chlorophyll concentration, each of which is a mean of the samples taken from 6-8 leaf disks in each pool.Control： the wild and OE plants grew in the irrigated condition;Stress： four-week old wild and OE plants were subjected to progressive drought for seven days.

2.6　BnA7HSP70超表達(dá)植株表現(xiàn)出對(duì)衣霉素的抗性

超表達(dá)BnA7HSP70基因能夠減輕和延緩干旱脅迫對(duì)葉片細(xì)胞的損傷, 衣霉素是一種糖基化酶抑制劑, 能夠抑制植物細(xì)胞生長(zhǎng)令其死亡。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株對(duì)衣霉素的耐受性, 對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的種子用2.5 μg mL-1的衣霉素處理, 見(jiàn)到轉(zhuǎn)基因植株能夠正常發(fā)芽, 并且根系長(zhǎng)度明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖7-A)。在MS固體培養(yǎng)基上添加5.0μg mL-1衣霉素, 處理轉(zhuǎn)基因材料2周, 發(fā)現(xiàn)其根系發(fā)育優(yōu)于野生型。將非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因T1代種子在含有10 μg mL-1衣霉素的MS固體培養(yǎng)基上發(fā)芽5～6 d, 之后轉(zhuǎn)移到無(wú)衣霉素的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子能夠繼續(xù)生長(zhǎng)為植株, 而非轉(zhuǎn)基因種子不能萌發(fā)最后死亡。在非轉(zhuǎn)基因油菜生長(zhǎng)到四葉期時(shí)用5.0 μg mL-1衣霉素處理1周, 會(huì)誘導(dǎo)葉片發(fā)黃, 繼而出現(xiàn)壞死斑; 而轉(zhuǎn)基因植株在處理 1周后葉片受到脅迫程度低于非轉(zhuǎn)基因植株(圖7-B)。為進(jìn)一步量化對(duì)衣霉素的耐受性, 利用Evans Blue染葉片, 在衣霉素處理1周后的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料中表現(xiàn)出差別, 隨著處理時(shí)間的增加, 轉(zhuǎn)基因植株葉片死細(xì)胞數(shù)目顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株葉片(圖7-C)。

圖6　BnA7HSP70超表達(dá)能夠延遲逆境下轉(zhuǎn)基因植株的葉片衰老相關(guān)基因表達(dá)Fig. 6　BnA7HSP70 overexpression delays drought-induced leaf senescence in OE lines confronted with stress野生型(WT)和超表達(dá)(OE)轉(zhuǎn)基因家系(OE2、OE3、OE7和OE8)在生長(zhǎng)4周后斷水10 d, 取樣檢測(cè)油菜葉片衰老相關(guān)基因BnLSC45和BnLSC222的表達(dá)。Control： 正常灌溉條件下的植株。Stress： 受到干旱脅迫后的植株。每次實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。干旱條件下誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因BnLSC45 和BnLSC222基因的表達(dá)。從正常灌溉和斷水脅迫處理下的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植株成熟葉片中提取RNA, 用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因的表達(dá)量。Drought was induced in wild type (WT) and OE transgenic plants(OE2, OE3, OE7, and OE8) at four-week old stage by withholding irrigation for 10 days. Control： normally irrigated plants. Stress：drought-stressed plants. Values are given as mean SD from three replicates. The experiment of senescence-associated genes BnLSC45 and BnLSC222 was induced by drought treatment. Total RNA was isolated from irrigated and drought-stressed mature leaves of wild plants and OE lines, and gene induction was monitored by quantitative RT-PCR using gene-specific primers.

2.7　BnA7HSP70基因超表達(dá)后緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)途徑中相關(guān)基因表達(dá)

植物遭受逆境脅迫時(shí), 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)為網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤蛋白的折疊與未折疊蛋白聚集和鈣離子平衡紊亂。BnA7HSP70所介導(dǎo)途徑能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白的聚集, 從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行衣霉素處理 72 h, 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因如幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶基因BnBiP3, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)磷酸化的鈣聯(lián)接蛋白基因BnCNX1的表達(dá)量(圖8)。在轉(zhuǎn)基因家系中,BnCNX1在衣霉素處理24 h后誘導(dǎo)表達(dá), 表達(dá)量在48 h后趨于平緩, 72 h后下降。BnBiP3基因的表達(dá)模式和BnCNX1的表達(dá)時(shí)空性相同。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和滲透脅迫過(guò)程中, 編碼天冬酰胺富集蛋白相關(guān)基因BnNRP所介導(dǎo)的途徑傳遞來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后細(xì)胞死亡信號(hào), 反饋植物體對(duì)于脅迫后的反應(yīng)。在非轉(zhuǎn)基因植株中,BnNRP在處理24 h后誘導(dǎo)表達(dá), 處理48 h其表達(dá)量達(dá)到最高水平, 而在轉(zhuǎn)基因植株受到逆境脅迫后BnNRP基因并未被快速誘導(dǎo)表達(dá), 其基因表達(dá)量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。以上結(jié)果表明,BnA7HSP70基因超表達(dá)后延緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后出現(xiàn)的細(xì)胞死亡相關(guān)基因的表達(dá), 從而能夠減輕逆境脅迫對(duì)植物體生長(zhǎng)的影響。

3　討論

3.1　油菜中超表達(dá)BnA7HSP70基因能夠減輕干旱以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫

在甘藍(lán)型油菜中, 超表達(dá)BnA7HSP70基因能夠顯著提高油菜在干旱脅迫處理下的耐受性。當(dāng)植株受到干旱脅迫時(shí), 在細(xì)胞水平上會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)的損傷, 在防止細(xì)胞結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步受損中, 植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)逆境適應(yīng)性。BnA7HSP70基因在植物面對(duì)逆境時(shí)起到以上作用。當(dāng)BnA7HSP70基因超表達(dá)時(shí), SOD酶活力的提高和細(xì)胞脂膜過(guò)氧化程度的下降能夠反映出干旱脅迫后植物的抗氧化防御系統(tǒng)啟動(dòng), 減輕了細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度; 油菜中超表達(dá)BnA7HSP70基因調(diào)控參與UPR和NPR途徑中基因表達(dá), 維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài), 使得植物體適應(yīng)性地對(duì)待逆境。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因BiP3參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滲透脅迫中NRP介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑, 在轉(zhuǎn)基因植株中BnBiP3基因的表達(dá)量比野生型降低, 表明BnA7HSP70超表達(dá)后負(fù)調(diào)控 NRP介導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)基因的表達(dá), 在轉(zhuǎn)基因植株逆境脅迫后的表型上表現(xiàn)為延遲脅迫后的葉片衰老, 增強(qiáng)了脅迫后的適應(yīng)性。

3.2　BnA7HSP70基因超表達(dá)后間接調(diào)控逆境脅迫途徑

圖7　BnA7HSP70超表達(dá)植株表現(xiàn)出對(duì)衣霉素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的耐受性Fig. 7　BnA7HSP70 overexpression increases resistance against tunicamycin (TUN)-induced cell death(A)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株種子和幼苗對(duì)2.5 μg mL-1或者5.0 μg mL-1衣霉素的敏感性實(shí)驗(yàn)。(B)～(C) Evans Blue染色方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株在衣霉素處理后7 d、14 d的細(xì)胞死亡程度。Abs (600 nm)測(cè)定值反映死細(xì)胞含量, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(A) Seeds and seedlings from overexpressed plants (OE) and untransformed wild-type (WT) plants were exposed to 2.5 μg mL-1 or 5.0 μg mL-1 tunicamycin. (B)-(C) Seedlings were monitored for the development of chlorosis and necrotic lesions, and cell viability were measured by the Evans blue dye method. Abs (600 nm) reflects the dead cell content. The values represent the average of three replicates (±SD).

圖8　衣霉素處理后轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的標(biāo)簽基因的表達(dá)分析Fig. 8　Gene expression analysis of senescence and cell death-associated genes in wild type and OE plants under tunicamycin treatment取衣霉素處理0、24、48和72 h的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植株的葉片, 分析內(nèi)源BnA7HSP70、BnCNX1、BnNRP和BnBiP3基因的表達(dá)量。DMSO處理的植株為對(duì)照。BnCNX1、BnBiP3和BnNRP基因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的標(biāo)志基因。Total RNA were isolated from wild type and transgenic plant leaves at 0, 24, 48, and 72 h of treatment, and the endogenous BnA7HSP70,BnCNX1, BnBiP3, and BnNRP in wild type and OE transgenic plants treatment with tunicamycin and the control DMSO were monitored by qRT-PCR. The bars indicate the confidence interval (P ＜ 0.05, n = 3). BnCNX1, BnBiP3, and BnNRP are ER stress markers.

動(dòng)物系統(tǒng)保證逆境脅迫后細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)時(shí), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶基因會(huì)結(jié)合ATF6基因, 阻止該基因的高爾基體定位信號(hào), 從而導(dǎo)致其不能通過(guò)分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。植物在逆境下, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊的蛋白數(shù)量逐漸增多, 當(dāng)超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡后, 會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脅迫應(yīng)答反應(yīng)。在擬南芥中, 分子伴侶基因與未折疊蛋白結(jié)合后, 使之前結(jié)合的 bZIP28從復(fù)合體中釋放出來(lái), 隨著bZIP28基因激活表達(dá),引發(fā)細(xì)胞核中脅迫相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)如編碼含有BiP3、HSP90-like、鈣聯(lián)動(dòng)蛋白、DNA J domain蛋白相關(guān)基因、二硫化物相關(guān)蛋白等表達(dá)[25-28]。本研究中超表達(dá)BnA7HSP70能夠誘導(dǎo)一系列保護(hù)機(jī)制,如BnCNX1和BnBiP3基因的表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因植株降低。分析BnCNX1和BnBiP3基因的啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)存在 ERSE-I (CCAAT-N10-CACG), ERSE-II(ATTGG-N2-CACG), XBP1-BS (GA-TGACGT-GK)和UPRE (TGACGT-GR)保守結(jié)構(gòu)域, 這些組分在擬南芥中被認(rèn)為是受衣霉素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)基因的啟動(dòng)子中保守元件。在BnBiP3基因啟動(dòng)子中存在著2個(gè)ERSE-I結(jié)構(gòu)域包含著CCAAT box和bZIP因子結(jié)合位點(diǎn) CACG; 在BnCNX1基因的啟動(dòng)子中存在著ERSE和XBP1-BS結(jié)構(gòu)域。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)形成同源或者異源二聚體來(lái)行使功能的。根據(jù)前人研究結(jié)果推測(cè)在非轉(zhuǎn)基因的材料中, 受到逆境脅迫后BnA7HSP70表達(dá)的蛋白與未折疊蛋白結(jié)合, 使其從 bZIP28轉(zhuǎn)錄因子上釋放出來(lái), bZIP28轉(zhuǎn)錄因子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體上, 被SIP和S2P類蛋白剪切后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中后結(jié)合到BnCNX1和BnBiP3基因的啟動(dòng)子區(qū)域, 從而使得這些基因上調(diào)表達(dá)。當(dāng)BnA7HSP70基因超表達(dá)后, 有足夠的蛋白質(zhì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后未折疊蛋白結(jié)合, 協(xié)助未折疊蛋白行使正確功能, 而與bZIP28結(jié)合的BnA7HSP70蛋白不會(huì)釋放, 從而阻止了bZIP28向高爾基體的轉(zhuǎn)移, 進(jìn)而不會(huì)上調(diào)下游BnCNX3和BnBiP3基因的表達(dá)(圖9)。

圖9　BnA7HSP70調(diào)控bZIP 28基因介導(dǎo)的未折疊蛋白途徑的模式Fig. 9　Model for BnA7HSP70 expression on the mobilization of bZIP28 and upregulation of UPR genes(A)在逆境脅迫下, BnA7HSP70蛋白與未折疊蛋白結(jié)合后從bZIP 28中釋放下來(lái), 定位于高爾基體的S1P和S2P將bZIP 28蛋白水解后釋放得到bZIP 28n, 轉(zhuǎn)錄因子bZIP 28n定位到細(xì)胞核中上調(diào)BnBiP3和BnCNX1基因的表達(dá); (B)當(dāng)BnA7HSP70超表達(dá)后, 得到足夠的BnA7HSP70蛋白質(zhì)與bZIP28和脅迫下產(chǎn)生的未折疊蛋白結(jié)合, 使得bZIP28保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 從而不會(huì)上調(diào)細(xì)胞核中基因的表達(dá)。(A) In response to the stress, BnA7HSP70 is competed away by the accumulation of misfolded proteins and bZIP28 is proteolytically activated by Golgi-localized S1P or S2P to release bZIP28n, which relocates to the nucleus where it upregulates stress genes including BnBiP3 and BnCNX1; (B) When BnA7HSP70 is overexpressed, accumulated BnA7HSP70 is enough for association with bZIP28 and misfolded proteins. As a result, bZIP28 is detained in the ER even under stress conditions.

4　結(jié)論

從甘藍(lán)型油菜中克隆干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因BnA7HSP70, 該基因超表達(dá)的植株在缺水條件下有著更高的相對(duì)含水量, 更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力和較低的脂質(zhì)膜過(guò)氧化性, 表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫的耐受性。此外, 轉(zhuǎn)基因植株的幼苗在萌發(fā)期表現(xiàn)出對(duì)糖基化抑制劑衣霉素處理的耐受性。BnA7HSP70基因能夠調(diào)控逆境脅迫下細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白途徑(UPR Pathway)和N-rich protein途徑(NRP pathway)中相關(guān)基因表達(dá), 保持逆境脅迫后細(xì)胞的穩(wěn)態(tài), 緩解逆境下植株應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的損傷。

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