肖明綱　 宋鳳景　 孫　兵　 左　辛　 趙廣山　 辛愛華　 李柱剛,*

1黑龍江省農業(yè)科學院博士后科研工作站, 黑龍江哈爾濱 150086; 2黑龍江省農業(yè)科學院耕作栽培研究所/黑龍江省寒地作物生理生態(tài)實驗室/黑龍江省作物分子設計與種質創(chuàng)新重點實驗室, 黑龍江哈爾濱 150086; 3青島市農業(yè)科學研究院, 山東青島 266109; 4黑龍江省農業(yè)科學院農村能源研究所, 黑龍江哈爾濱 150086; 5佳木斯市農業(yè)技術推廣總站, 黑龍江佳木斯 154002

玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是由大斑凸臍蠕孢(Exserohlium turcicumPass. Leonard et Suggs)侵染引致的玉米生產中一種重要的葉部病害, 在我國主要分布于東北地區(qū)、華北北部和西南地區(qū)等氣候較涼爽的玉米種植區(qū), 常造成大面積減產[1]。20世紀 80年代, 由于感病雜交種的淘汰, 有效遏制了大斑病在我國的大范圍流行[2-3]。20世紀90年代, 因抗病雜交種的大面積推廣種植, 病原菌產生了新的生理小種, 大斑病危害再次升級[4]。2002年以來, 大斑病危害呈回升趨勢, 2003—2006年在東北春玉米區(qū)大斑病大范圍嚴重發(fā)生, 對生產造成較大影響[5]。因氣候條件適宜, 病原菌致病力分化, 感病品種及其相似品種的大面積種植, 2012—2017年玉米大斑病連續(xù)重度發(fā)生, 對玉米生產造成嚴重影響。

迄今, 已報道的玉米抗大斑病主效基因有 10個, 被分別定位在第1、第2、第3、第7和第8染色體上, 其中Ht1、Ht2、Ht3、HtN、HtM、HtP、NNc和St為顯性單基因,ht4和rt為隱性基因[6-12]。Ht1基因已經廣泛應用于國內外的育成品種中, 在20世紀80年代, 我國利用抗大斑病自交系Mo17為親本選育出一批抗病雜交種, 有效遏制了大斑病在我國的大范圍流行。

在我國東北地區(qū)、華北北部和西南等玉米種植區(qū), 涼爽的氣候條件利于玉米大斑病流行爆發(fā)而造成大面積減產[1-5]。培育和種植抗病品種是控制玉米病害、減少產量損失的有效途徑, 而優(yōu)異的抗性資源則是進行玉米抗病育種的基礎。目前玉米大斑病在我國各玉米區(qū)發(fā)生越來越普遍, 危害也越來越嚴重, 針對這種情況, 我們利用人工接種方法, 對引自美國、德國、法國和俄羅斯的 43份玉米種質資源進行抗性鑒定和評價, 篩選抗性資源, 探究其真實抗性水平, 為我國玉米抗大斑病育種提供基礎材料和抗性信息; 利用 F2群體對高抗大斑病材料進行了初步的抗性遺傳分析, 利用生產上的優(yōu)勢小種和強致病力小種進行了抗譜分析, 為進一步定位和利用其抗大斑病基因奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　供試自交系

43份外引自交系, 其中美國30份、法國6份、俄羅斯4份、德國3份; 自交系Mo17 (MR)和獲白(HS)為抗感對照。

1.2　供試病原菌

大斑凸臍蠕孢(Exserohilum turcicum), 分離自黑龍江省玉米發(fā)病葉片。

1.3　抗病鑒定圃設置

玉米大斑病抗性鑒定圃設置在位于哈爾濱市民主鄉(xiāng)的黑龍江省農業(yè)科學院耕作栽培研究所實驗基地。每份材料種植2行, 行長5 m, 行距0.65 m, 每行留苗25～30株,株距略小于大田生產, 田間正常管理。2015年和2016年對 2014年鑒定得到的抗病材料進行重復鑒定, 以探究其真實抗性。

1.4　人工接種及抗性評價

1.4.1玉米大斑病接種方法將菌種接種于經高壓滅菌的高粱粒上, 在23～25℃黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲布滿高粱粒, 用水洗去高粱粒表面菌絲體, 攤鋪于潔凈瓷盤中,保持高濕度, 在室溫和黑暗條件下培養(yǎng)。鏡檢確認大量產生分生孢子后, 直接用水淘洗高粱粒, 配制接種懸浮液。待玉米展 13葉期時利用孢子懸浮液噴霧接種, 乳熟后期調查[1]。

1.4.2玉米大斑病抗性評價調查每份鑒定材料群體的發(fā)病狀況, 調查重點部位為玉米果穗的上方葉片和下方3葉。病斑占葉面積少于或等于5%為1級(HR), 占葉面積6%～10%為3級(R), 占葉面積11%～30%為5級(MR),占葉面積31%～70%為7級(S), 全株葉片基本為病斑覆蓋,葉片枯死為9級(HS)[1]。

1.5　高抗材料大斑病抗性遺傳初步分析

用7份高抗外引材料分別與感病自交系獲白雜交, 產生F2分離群體, 在玉米13葉期時人工接種相應的F2群體和感病對照獲白, 乳熟后期調查每個 F2植株玉米果穗的上方葉片和下方3葉的總體發(fā)病狀況[1]。計算各群體抗、感個體的分離比例, 用 SAS 8.2軟件(SAS Institute, Raleigh, NC, USA) 計算分離比例的χ2值和概率值, 進行分離比例的適合性測驗。

1.6　高抗材料抗譜分析

1.6.1幼苗的準備種子經2%的次氯酸鈉表面消毒處理后, 在 25℃下催芽 3～4 d。待萌動后, 分別播于 10 cm×10 cm 的花盆內, 每盆播種 4粒, 出苗后每盆保苗 3株[13]。

1.6.2接種液制備將生理小種0、1、2、N、123N純培養(yǎng)接種到高粱粒培養(yǎng)基上擴繁, 待產生分生孢子后用純凈水沖洗制成孢子懸浮液, 孢子濃度 1×105～1×106個mL-1, 滴加0.1%吐溫振蕩搖勻即可用于接種[13]。

1.6.3人工噴霧接種待幼苗長至 8～10葉期時進行噴霧接種。接種后保濕 24 h, 然后溫室進行正常管理, 室內溫度控制在25℃左右。接種2周后進行發(fā)病調查[13]。

1.6.4病斑調查R型： 條狀萎蔫褪綠斑或褐色窄條形的壞死斑, 有時有黃色暈圈, 不產生或很少產生孢子;S型： 梭狀大型斑, 中間明顯壞死, 病斑周圍有明顯的萎蔫中毒區(qū), 條件適宜時產生大量褐色霉層[13]。

2　結果與分析

2.1　引進材料對玉米大斑病抗性評價

2014年利用孢子懸浮液噴霧接種法對43份外引自交系進行了抗大斑病人工接種鑒定, 感病對照獲白病斑占葉片總面積的比率為90%, 而抗病對照Mo17病斑占葉片總面積的比率為15%, 抗感對照抗病性差異顯著, 能夠有效區(qū)分待鑒定材料的真實抗性, 表明人工接種鑒定結果有效。2014年, 從43份鑒定資源中共篩選到高抗材料7份, 抗病材料 1份, 中抗材料 6份, 高感材料 7份, 感病材料22份(圖1)。

從上述鑒定結果可以看出, 引進的43份國外資源, 在大斑病抗性方面具有廣泛的變異, 來源于美國的自交系A04高抗大斑病, 來源于德國的自交系 G03高感大斑病(圖2), 其中的抗性材料對豐富我國玉米抗大斑病種質資源、拓寬其遺傳基礎具有重要利用價值。

圖1　外引材料2014年大斑病抗性級別分布Fig. 1　Distribution of northern corn leaf blight resistance score for foreign maize inbred lines in 2014HR： 高抗; R： 抗; MR： 中抗; S： 感; HS： 高感。HR： highly resistant; R： resistant; MR： moderately resistant;S： susceptible; HS： highly susceptible.

圖2　外引材料高抗和高感大斑病田間表型Fig. 2　Field phenotype of foreign maize inbred lines highly resistant and highly sensitive to northern corn leaf blightA04、G03： 自交系; HR： 高抗; HS： 高感。A04, G03： inbred lines; HR： highly resistant; HS： highly susceptible.

2.2　外引材料抗玉米大斑病重復鑒定

2015年和2016年對14份抗大斑病材料, 又進行了連續(xù)2年的重復鑒定, 感病對照獲白病斑占葉片總面積的比率分別為90%和95%, 抗病對照Mo17病斑占葉片總面積的比率分別為25%和20%, 抗感對照充分發(fā)病, 人工接種鑒定有效。結果發(fā)現(xiàn), 這些材料年際間大斑病抗性表現(xiàn)穩(wěn)定, 反應了其真實抗病性, 具體鑒定結果如表1所示。這些材料可作為重要的抗大斑病資源, 用于改善我國玉米抗大斑病種質遺傳基礎狹窄的現(xiàn)狀。

2.3　高抗大斑病材料抗性遺傳初步分析

7份供試自交系對大斑凸臍蠕孢的反應型均表現(xiàn)為高抗, 而感病親本獲白則為高感。根據(jù)各供試材料與獲白配制的雜種F2植株對大斑凸臍蠕孢的反應型, A04/獲白、F02/獲白、F05/獲白和 R01/獲白這些 F2群體抗、感植株比例都符合 3∶1的分離比, 而 A11/獲白、A24/獲白和G02/獲白的F2群體抗、感植株比例不符合3∶1的分離比(表2), 說明A04、F02、F05和R01對大斑凸臍蠕孢的抗性可能受1對顯性單基因或少數(shù)主效基因控制。

2.4　高抗大斑病材料抗譜分析

遺傳分析表明, 自交系 A04、F02、F05和 R01對玉米大斑病的抗性均受1對顯性單基因控制。因此, 利用當前優(yōu)勢小種0和1號、2號生理小種、N號生理小種及強致病力小種123N對A04、F02、F05和R01進行了抗譜分析。生理小種0、1、2、N及123N對A04、F02、F05和 R01均無毒性, 而強致病力小種 123N對Ht1、Ht2、Ht3和HtN均有毒性, A04、F02、F05和R01對4個生理小種的反應型均不同于Ht1、Ht2、Ht3和HtN的反應型(表3)。說明自交系 A04、F02、F05和 R01對大斑病的抗性不同于已定位的抗大斑病基因Ht1、Ht2、Ht3和HtN, 可能攜帶新的抗病基因。

表1　14份外引材料對玉米大斑病多年抗性鑒定Table 1　Identification of resistance to northern corn leaf blight of 14 foreign inbred lines across years

表2　7個F2群體對大斑凸臍蠕孢的抗性反應Table 2　Reactions of seven F2 populations to Exserohilum turcicum of northern corn leaf blight

表3　4份玉米自交系對0、1、2、N和123N的反應型Table 3　Infection types in the four foreign inbred lines to isolates 0, 1, 2, N, and 123N of northern corn leaf blight

3　討論

玉米對大斑病的抗性有兩種遺傳類型, 即質量遺傳抗性和數(shù)量遺傳抗性, 這兩種抗性均廣泛應用于玉米抗病育種中[11,14]。

質量抗性, 也叫小種?；剐? 是受顯性單基因控制的垂直抗性。質量抗性基因在控制玉米大斑病危害方面取得過顯著成效[15]。但長期大面積種植同一抗源選育的品種, 由于病菌與寄主互作具有普遍的基因對基因關系, 很容易使有效的抗病基因隨著病菌對定向選擇壓力的適應性變異而失去作用, 形成所謂的“抗性”喪失現(xiàn)象[5,15-16]。因此, 尋找更多、更有效、更易利用的抗病自交系或基因資源是當前我國玉米抗病育種的一項十分緊迫的任務。

自交系A04株型清秀, 年際間抗性穩(wěn)定, 病斑面積占總葉片面積的比率為 1%, 其最大特點是脫水快、適宜直收; F02和F05株高和穗位較低, 粒深軸細, 產量高, 年際間病斑面積占葉片總面積的比率有波動, 最高分別為 3%和2%; R01抗低溫能力較強, 年際間抗性穩(wěn)定, 病斑面積占葉片總面積的比率為4% (表1)。以病情級別為唯一標準, 對A04、F02、F05和R01進行抗性遺傳分析和多小種鑒定, 結果表明, A04、F02、F05和R01對大斑病的抗性受一對顯性單基因控制(表 2), 且可能攜帶有新基因(表 3)。對 A04、F02、F05和 R01攜帶的抗病基因精細定位、克隆和功能驗證, 以豐富我國玉米抗大斑病基因資源, 開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標記, 利用分子標記輔助選擇及回交轉育等手段, 提高我國當前玉米生產上常用種質抗病性的同時, 也可改善目標材料的脫水性、耐冷性, 對于培育高產廣適品種和資源創(chuàng)制具有重要指導意義。

數(shù)量抗性, 屬水平抗性, 在遺傳上受多基因控制, 對所有大斑病菌的生理小種均有效。大斑病數(shù)量抗性基因分布在玉米12條染色體上的整個基因組[11,17-18], 因其抗性持久且不易被新的生理小種克服而受到廣泛重視[19]。通過構建不同的群體材料, 許多玉米抗大斑病 QTLs位點被定位[20-23],qNLB8.06DK888被精細定位在第 8染色體 0.46 MB的區(qū)間內,qNLB1.06被限定在3.60 MB的區(qū)間內[24-25]。

A11和A24具有配合力高、耐密植等優(yōu)點, 高抗大斑病且抗性穩(wěn)定, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比分別為5%和0; G02硬粒型, 稈韌性好, 抗倒性極強, 高抗大斑病且抗性穩(wěn)定, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比有波動, 分別為0、1%和0 (表1)。以病情級別為指標, A11/獲白、A24/獲白和 G02/獲白的 F2群體抗、感植株比例既不完全符合 3∶1的分離比, 也不符合15∶1的分離比例(表2)。如果綜合考慮病情級別、病斑大小和年際間環(huán)境因素的影響, A11和G02對大斑病的抗性很有可能受數(shù)量性狀控制。但 A24三年鑒定沒有發(fā)現(xiàn)病斑, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比均為 0, 其抗性遺傳規(guī)律有待做進一步的深入研究, 以期發(fā)掘具有持久抗性且耐密、抗倒的玉米優(yōu)異資源。

盡管質量抗性基因和數(shù)量抗性基因有著明顯的不同,但是在某些情況下, 質量抗性基因更像是一個主效QTL[26-27]。F02和F05年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比有波動, 分別為1%、3%、3%和2%、1%、1%,而A04和R01年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比比較恒定, 分別為 1%和 4%(表 1), 但病斑數(shù)量、病斑長度和寬度可能有差異。僅根據(jù)病情級別, A04、F02、F05和 R01對大斑病的抗性可能受一對顯性單基因控制,而如果綜合考慮病情級別、病斑大小、環(huán)境因素及多小種鑒定結果, A04、F02、F05和R01對大斑病的抗性也可能受少數(shù)主效 QTL控制, 存在微效基因的作用。質量單基因或主效QTL定位將是下一步工作重點。

[1] 王曉鳴, 石潔, 晉齊鳴, 李曉, 孫世賢. 玉米病蟲害田間手冊.北京： 中國農業(yè)科學技術出版社, 2010. pp 1, 250, 264-265 Wang X M, Shi J, Jin Q M, Li X, Sun S X. Field Manual of Maize Pests and Diseases. Beijing： China Science and Technology Press, 2010. pp 1, 250, 264-265 (in Chinese)

[2] 溫義鵬, 李成軍, 于培洋, 從方志, 郭寶貴, 朱秀森, 姜傅俊,劉偉. 不同玉米自交系對大斑病和灰斑病抗性分析. 玉米科學, 2012, 20(1)： 135-137 Wen Y P, Li C J, Yu P Y, Cong F Z, Guo B G, Zhu X S, Jiang F J, Liu W. Resistance analysis on the northern leaf blight and the gray leaf spot of the corn inbred lines.J Maize Sci, 2012, 20(1)：135-137 (in Chinese with English abstract)

[3] 張小利. 玉米應答大斑菌侵染的蛋白質組學與抗南方銹病新基因的挖掘. 中國農業(yè)科學院博士學位論文, 北京, 2013 Zhang X L. Proteomic Analysis of Maize Infected bySetosphaeria turcicaand Discovery of New Resistance Gene to Southern Corn Rust. PhD Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2013 (in Chinese with English abstract)

[4] Wang X M, Zhang Y H, Xu X D, Li H J, Wu X F, Zhang S H, Li X H. Evaluation of maize inbred lines currently used in Chinese breeding programs for resistance to six foliar diseases.Crop J,2014, 2： 213-222

[5] 王曉鳴, 晉齊鳴, 石潔, 王作英, 李曉. 玉米病害發(fā)生現(xiàn)狀與推廣品種抗性對未來病害發(fā)展的影響. 植物病理學報, 2006,36： 1-11 Wang X M, Jin Q M, Shi J, Wang Z Y, Li X. The status of maize diseases and the possible effect of variety resistance occurrence in the future.Acta Phytopathol Sin, 2006, 36： 1-11 (in Chinese with English abstract)

[6] Van Staden D, Lambert C A, Lehmensiek A. SCAR markers for theHt1,Ht2,Ht3andHtn1resistance genes in maize.Maize Genet Conf Abs, 2001, 43： 134

[7] Chung C L, Jamann T, Longfellow J, Nelson R. Characterization and fine-mapping of a resistance locus for northern leaf blight in maize bin 8.06.Theor Appl Genet, 2010, 121： 205-227

[8] Simcox K D, Bennetzen J L. The use of molecular markers to studySetosphaeria turcicaresistance in maize.Phytopathology,1993, 83： 1326-1330

[9] Robbins J W, Warren H. Inheritance of resistance toExserohilum turcicumin PI 209135, “Mayorbela” variety of maize.Maydica,1993, 38： 209-213

[10] Ogliari J B, Guimar?es M A, Camargo L E A. Chromosomal locations of the maize (Zea maysL.)HtPandrtgenes that confer resistance toExserohilum turcicum.Genet Mol Biol, 2007, 30：630-634

[11] Welz H, Geiger H. Genes for resistance to northern corn leaf blight in diverse maize populations.Plant Breed, 2000, 119： 1-14[12] Martin T, Biruma M, Fridborg I, Okori P, Dixelius C. A highly conserved NB-LRR encoding gene cluster effective againstSetosphaeria turcicain sorghum.BMC Plant Biol, 2011, 11： 151

[13] 王玉萍, 王曉鳴, 馬青. 我國玉米大斑病菌生理小種組成變異研究. 玉米科學, 2007, 15(2)： 123-126 Wang Y P, Wang X M, Ma Q. Races ofExserohihun turcicum,causal agent of northern leaf blight in China.J Maize Sci, 2007,15(2)： 123-126 (in Chinese with English abstract)

[14] 楊繼良, 王斌. 玉米大斑病抗性遺傳的研究進展. 遺傳, 2002,24： 501-506 Yang J L, Wang B. The research advancement on genetics of resistance toExserohihun turcicumin maize.Genetics(Beijing),2002, 24： 501-506 (in Chinese with English abstract)

[15] 趙桂東, 劉荊, 陸化森, 王偉新. 夏玉米大斑病發(fā)生規(guī)律及影響病害消長因素的研究. 玉米科學, 1995, 3(2)： 79-80 Zhao G D, Liu J, Lu H S, Wang W X. Study on the occurrence regularity and the factors affecting the growth and decline of summer northern corn leaf blight.Maize Sci, 1995, 3(2)： 79-80(in Chinese with English abstract)

[16] 趙書文, 楊秀林, 郭東. 玉米大斑病的流行原因與綜合治理措施. 中國植保導刊, 2005, 25(3)： 10-12 Zhao S W, Yang X L, Guo D. Epidemic causes ofExserochilum turcicumand its integrated management measures.China Plant Prot, 2005, 25(3)： 10-12 (in Chinese with English abstract)

[17] Wisser R J, Balint-Kurti P J, Nelson R J. The genetic architecture of disease resistance in maize： a synthesis of published studies.Phytopathology, 2006, 96： 120-129

[18] Ali F, Yan J B. The phenomenon of disease resistance in maize and the role of molecular breeding in defending against global threat.J Int Plant Biol, 2012, 54： 134-151

[19] Parlevliet J E. Durability of resistance gaginst fungal, bacterial and viral pathogens; present situation.Euphytica, 2002, 124：147-156

[20] Chung C L, Longfellow J, Walsh E K, Kerdieh Z, Esbroeck G V,Balint-Kurti P, Nelson R J. Resistance loci affecting distinct stages of fungal pathogenesis： use of introgression lines for QTL mapping and characterization in the maizeSetosphaeria turcicapathosystem.BMC Plant Biol, 2010, 10： 103

[21] Chung C L, Poland J, Kump K, Benson J, Longfellow J, Walsh E,Balint-Kurti P, Nelson R. Targeted discovery of quantitative trait loci for resistance to northern leaf blight and other diseases of maize.Theor Appl Genet, 2011, 123： 307-326

[22] Ploand J A, Bradbury P J, Buckler E S, Nelson R J. Genome-wide nested association mapping of quantitative resistance to northern leaf blight in maize.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108：6893-6898

[23] Chen G S, Wang X M, Long S S, Jaqueth J, Li B L, Yan J B,Ding J Q. Mapping of QTL conferring resistance to northern corn leaf blight using high-density SNPs in maize.Mol Breed, 2016,36： 4

[24] Chung C L, Jamann T, Longfellow J, Nelson R. Characterization and fine-mapping of a resistance locus for northern leaf blight in maize bin 8.06.Theor Appl Genet, 2010, 121： 205-227

[25] Jamann T M, Poland J A, Kolkman J M, Smith L G, Nelson R J.Unraveling genomic complexity at a quantitative disease resistance locus in maize.Genetics, 2014, 198： 333-334

[26] Badu-Apraku B, Gracen V, Bergstrom G. A major gene for resistance to anthracnose stalk rot in maize.Phytopathology, 1987, 77：957-959

[27] Jung M, Weldekidan T, Schaff D, Paterson A, Tingey S, Hawk J.Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of anthracnose stalk rot genes in maize.Theor Appl Genet, 1994,89： 413-418