武劍楠　孔成成　霍鳳敏　孫照剛

據(jù)世界衛(wèi)生組織[1]報告，2016年全球結(jié)核病患者約1040萬例，結(jié)核病死亡人數(shù)約167.4萬例(其中37.4萬例為HIV陽性者)，全球結(jié)核病的嚴峻形勢仍不容樂觀。開發(fā)和加強新的結(jié)核病實驗室診斷方法對于控制和消滅結(jié)核病有著重要的作用。CDG-3熒光探針[β-內(nèi)酰胺酶(BlaC)特異性綠色熒光探針]是由美國斯坦福大學新研發(fā)的，將可用于結(jié)核病實驗室檢測的量子點探針。CDG-3探針以結(jié)核分枝桿菌(MTB)β-內(nèi)酰胺酶(BlaC)為靶標，在BlaC的催化下，探針結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)斷裂，釋放出大量熒光，從而在熒光顯微鏡下進行檢測。從2006年起，CDG-3探針一直在被不斷改進，其衍生物用于結(jié)核分枝桿菌檢測的特異度和敏感度得到不斷提高[2-6]，而且價格較低[7]。國外已經(jīng)用CDG-3熒光探針對50例患者痰標本進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其敏感度(90%)和特異度(73%)都較好[5]。但國外實驗標本數(shù)較少，而且沒有進行除恥垢分枝桿菌外的其他非結(jié)核分枝桿菌(NTM)方面的研究。因此，本實驗旨在研究該探針是否能在鏡下區(qū)分NTM和MTB，并用CDG-3探針對200例患者痰標本進行檢測，以探討該探針用于結(jié)核病診斷的潛在可能性。

資料和方法

一、一般資料

1. 對人類致病的3種結(jié)核病病原菌標準株：H37Rv，牛和非洲分枝桿菌標準株，35種不同NTM標準株，及4種呼吸道感染病原菌的標準株均來自于北京結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫；另有2種呼吸道感染病原菌的標準株分別來自于中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心和中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

2. 選取2016年1月至9月于北京胸科醫(yī)院門診就診的疑似肺結(jié)核患者200例。所有患者的臨床診斷信息均來自于臨床醫(yī)生，按照我國肺結(jié)核診斷標準[8]，200例門診疑似肺結(jié)核患者中，最終確診結(jié)核病患者149例；確診NTM病3例，其中2例為胞內(nèi)分枝桿菌感染，1例為鳥分枝桿菌感染；確診呼吸道感染16例；肺鱗癌1例；因證據(jù)不充分未能確診31例。采用一次性無菌痰采集盒收集200例患者的晨痰3～5 ml，所有痰標本均為標本性狀屬于干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、黏液痰等合格的標本，不能即時處理的痰標本置于4 ℃冰箱中保存，并于24 h內(nèi)進行處理。

二、主要儀器與試劑

Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(BD公司，美國)，油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(培養(yǎng)基)[oleic acid-albumin-dextrose-catalase (medium)；簡稱“OADC”](BD公司，美國)，酸性羅氏培養(yǎng)基(珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司，中國)，LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)[生工生物工程(上海)股份有限公司，中國]，血平板(BioMérieux公司，法國)，BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(BD公司，美國)，熒光顯微鏡(Leicia公司，德國)，離心機(Sigma公司，德國)， CDG-3熒光探針(美國斯坦福大學醫(yī)學院)。

三、方法

1．CDG-3熒光探針檢測H37Rv、牛和非洲分枝桿菌、NTM及呼吸道感染病原菌標準株：將培養(yǎng)制備好的標準株菌液在渦旋振蕩器上震蕩15 s后，靜置2 min。取菌液上清500 μl于1.5 ml Eppendorf管(簡稱“EP管”)中，4500×g離心5 min；棄上清，加200 μl 磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)與沉淀物充分混合。取新的EP管，吸取50 μl上述步驟處理好的懸濁液與50 μl 20 μmol/L CDG-3探針充分混合后，避光孵育1 h。震蕩15 s，4500×g離心3 min；棄上清，加100 μl PBS沖洗3次，每次4500×g離心3 min。棄上清，加10 μl 0.1 mol/L CuSO4-NaCl溶液，混勻；吸取2 μl滴于載玻片上，蓋玻片封片后用熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。

2．CDG-3熒光探針檢測痰標本中MTB：取痰標本1 ml于15 ml離心管中，加入2倍量的2% N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉 (NALC-NaOH) 痰處理液，渦旋震蕩后靜置15 min。4500×g離心5 min；棄上清，加入50 μl PBS并轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。加50 μl 20 μmol/L CDG-3探針，避光孵育1 h。再次4500×g離心2 min；棄上清，加30 μl 0.1 mol/L CuSO4-NaCl溶液重懸，吸取2 μl滴于載玻片上，蓋玻片封片后，通過熒光顯微鏡觀察背景中細菌的亮度、顏色、形狀和大小，判斷并記錄結(jié)果。

3．金胺O熒光染色法：按照文獻[9]中的痰涂片查抗酸桿菌標準化操作程序執(zhí)行。

4．痰分枝桿菌培養(yǎng)法：采用酸性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照《結(jié)核病實驗室標準化操作與網(wǎng)絡建設》[10]中簡單法痰標本分枝桿菌培養(yǎng)標準操作規(guī)程進行操作；同時嚴格按照說明書以BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)進行快速培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)。二者只要有一種結(jié)果為陽性即認為培養(yǎng)陽性。

5．標準株β-內(nèi)酰胺酶蛋白序列比對：由于CDG-3熒光探針是針對BlaC設計的，通過其他細菌β-內(nèi)酰胺酶與H37Rv標準株BlaC氨基酸序列的比較，可以為某些標準株催化CDG-3熒光探針發(fā)出熒光的原因進行推測。從美國國立生物技術信息中心(NCBI)查找并下載H37Rv BlaC氨基酸序列，及CDG-3熒光探針檢測為陽性菌株的β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列；使用ClustalX 2.1軟件對所選序列進行多重序列比對。

四、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分別比較3種檢測方法的陽性率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；對CDG-3熒光探針檢測分別與金胺O熒光染色法、分枝桿菌培養(yǎng)法進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，Kappa值<0.4，認為一致性較差；0.4≤Kappa值<0.75，認為一致性一般；Kappa值≥0.75，認為一致性較好。

結(jié)　　果

一、CDG-3熒光探針檢測標準株結(jié)果

以H37Rv為標準，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌檢測結(jié)果皆為陽性。

35種NTM檢測結(jié)果為陽性者有3株，分別是堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌和草分枝桿菌(圖1～8)；陰性結(jié)果32株，分別為胞內(nèi)(圖9，10)、龜、偶然、戈登、海、鳥、 恥垢、瘰疬、蟾蜍、膿腫、潰瘍、蘇加、土地、非產(chǎn)色、次要、產(chǎn)鼻疽、金色、新金色、副偶然、胃、微黃、迪氏、猿猴、亞洲、塞內(nèi)加爾、抗熱、楚布、羅德島、奧布、泥炭酸、豬、南非分枝桿菌。

6種呼吸道感染病原菌中，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和黏質(zhì)沙雷菌檢測結(jié)果都為陰性，諾卡菌檢測結(jié)果為陽性(圖11，12)。

二、CDG-3熒光探針檢測陽性的標準株β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列比對結(jié)果

查找NCBI發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌的β-內(nèi)酰胺酶部分氨基酸序列與H37Rv BlaC氨基酸序列完全一致；CDG-3熒光探針檢測結(jié)果為陽性的NTM和呼吸道病原菌中，瑪爾摩分枝桿菌未找到A類β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列，僅發(fā)現(xiàn)B類酶即金屬β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列。

分別將堪薩斯分枝桿菌、草分枝桿菌和諾卡菌的A類β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列與H37Rv標準株BlaC氨基酸序列進行比對，一致性分別為76.21%(237/311)、36.98%(115/311)、46.45%(144/310)。

三、CDG-3熒光探針、金胺O熒光染色法和培養(yǎng)法檢測痰標本MTB結(jié)果

200份痰標本的培養(yǎng)采用羅氏固體培養(yǎng)和MGIT 960液體培養(yǎng)，二者只要有一種結(jié)果為陽性即認為培養(yǎng)陽性，羅氏固體培養(yǎng)法聯(lián)合MGIT960液體培養(yǎng)法(簡稱“培養(yǎng)法”)陽性檢出率為35.0%(70/200)。羅氏固體培養(yǎng)法和MGIT960液體培養(yǎng)法的陽性檢出率分別為30.5%(61/200)和34.5%(69/200)。

1. CDG-3熒光探針檢測痰標本MTB陽性率：CDG-3熒光探針檢測200份痰標本的陽性檢出率為53.0%(106/200)，高于金胺O熒光染色法(29.5%，59/200)與培養(yǎng)法(35.0%，70/200)的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為33.587、21.121，P值均為0.000)。CDG-3熒光探針檢測痰標本MTB陽性的106例患者中，96例(90.6%)經(jīng)臨床確診為結(jié)核病患者，1例(0.9%)確診為肺內(nèi)感染，9例(8.5%)為未確診患者。9例未確診的患者中，有 2例臨床醫(yī)生認為肺結(jié)核可能性大；另有2例患者進行Xpert MTB/RIF檢測，結(jié)果陽性。

2. CDG-3熒光探針檢測痰標本MTB的敏感度和特異度：以培養(yǎng)法結(jié)果為標準，CDG-3熒光探針檢測200份痰標本MTB的敏感度為84.3%(59/70)，高于金胺O熒光染色法(70.0%，49/70)；特異度為63.8%(83/130)，低于金胺O熒光染色法(92.3%，120/130)。由于CDG-3熒光探針法和MGIT960液體培養(yǎng)法都采用了離心集菌的方法，若以MGIT960液體培養(yǎng)結(jié)果為標準，CDG-3熒光探針法的敏感度和特異度分別為85.5%(59/69)和64.1%(84/131)，金胺O熒光染色法的敏感度和特異度分別為71.0%(49/69)和92.4%(121/131)。以未進行離心集菌步驟的羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為標準時，CDG-3熒光探針法的敏感度和特異度分別為88.5%(54/61)和62.6%(87/139)，金胺O熒光染色法的敏感度和特異度分別為80.3%(49/61)和92.8%(129/139)。

以臨床診斷為標準，CDG-3熒光探針檢測確診患者的169例痰標本MTB的敏感度為64.4%(96/149)，高于金胺O熒光染色法(39.6%，59/149)和培養(yǎng)法(44.3%，66/149)；特異度為95%(19/20)，低于金胺O熒光染色法(100%，20/20)，高于培養(yǎng)法(90%，18/20)。

金胺O熒光染色法、培養(yǎng)法和CDG-3熒光探針法檢測痰標本MTB及臨床診斷結(jié)果見表1。

對CDG-3熒光探針檢測與金胺O熒光染色法進行Kappa檢驗，Kappa=0.385，二者一致性較差；對CDG-3熒光探針檢測與培養(yǎng)法進行Kappa檢驗，Kappa=0.430，二者一致性一般。

討　　論

CDG-3熒光探針檢測是一種新開發(fā)的，將可能用于結(jié)核病實驗室診斷的新方法。CDG-3熒光探針是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的原理設計的一種能夠被BlaC激活的量子點探針，該探針與被熒光染料標記的BlaC底物通過鏈霉親和素固定結(jié)合[2]。

表1　臨床診斷與不同細菌學方法檢測200例患者痰標本的結(jié)果(例)

經(jīng)過不斷的改進，CDG-3熒光探針以MTB BlaC為靶標，通過酶的作用使其內(nèi)酰胺環(huán)斷裂后釋放熒光，之后在熒光顯微鏡下可觀察結(jié)果。這一特性使其可以檢測活菌，且檢測快速，僅用1 h左右即可得到結(jié)果[5]。據(jù)預測，將CDG-3熒光探針用于結(jié)核病的檢測，一次單項測試僅花費5美元[7]，這無疑可以為一些結(jié)核病患者減輕負擔。為進一步了解該方法在臨床中的應用價值，本研究對CDG-3熒光探針檢測MTB的專一性和200份痰標本的檢測效果進行了分析。

由于呼吸道感染和NTM病會對結(jié)核病的診斷造成一定的干擾，因此對呼吸道感染病原菌和NTM的鑒別很重要。CDG-3熒光探針是針對MTB BlaC設計的，不清楚其能否被痰中其他病原菌β-內(nèi)酰胺酶催化發(fā)光，即專一性尚待評估。研究結(jié)果顯示：CDG-3熒光探針檢測的標準株中，以H37Rv為標準，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌都得到陽性結(jié)果；35種NTM中，堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌和草分枝桿菌顯示陽性，其余為陰性；6種呼吸道感染病原菌中，諾卡菌為陽性，其余5種為陰性。結(jié)核病的病原菌為結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)，包括MTB、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，其中，前三者對人類致病，且人肺結(jié)核的致病菌90%以上為MTB。查找NCBI發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌的β-內(nèi)酰胺酶部分氨基酸序列與H37Rv BlaC氨基酸序列完全一致，這可能導致了CDG-3熒光探針檢測牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌的結(jié)果為陽性。其余得到陽性結(jié)果的菌株中，堪薩斯分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌都屬于緩慢生長分枝桿菌，可以引起肺部NTM病[11-12]；草分枝桿菌屬于快速生長分枝桿菌，沒有致病性[13]；諾卡菌感染的臨床發(fā)病率較低，多發(fā)生在免疫功能受損的患者，可引起肺部疾病，臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，且諾卡菌抗酸染色陽性，易被誤診為結(jié)核病[14-15]。有文獻報道，堪薩斯分枝桿菌和草分枝桿菌的β-內(nèi)酰胺酶活性較強[16]，且都產(chǎn)A類酶。而諾卡菌同樣產(chǎn)生A類β-內(nèi)酰胺酶[17]。因此，在此推測上述細菌的β-內(nèi)酰胺酶活性可能與MTB的BlaC相近，從而與CDG-3熒光探針發(fā)生反應，釋放熒光。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，堪薩斯分枝桿菌、草分枝桿菌和諾卡菌的A類β-內(nèi)酰胺酶與MTB的BlaC的氨基酸序列一致性分別為76.21%、36.98%和46.45%。值得注意的是，由于堪薩斯分枝桿菌為最常見的有臨床價值的NTM之一[18]，因此，若未來CDG-3熒光探針用于結(jié)核病實驗室痰標本MTB的檢測，應注意結(jié)果為堪薩斯分枝桿菌的可能性。從NCBI查找瑪爾摩分枝桿菌的β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列，僅發(fā)現(xiàn)B類酶，即金屬β-內(nèi)酰胺酶，該類酶主要是通過金屬離子與氨基酸形成配位化合物來干預活性位點的反應[19]，與BlaC沒有同源性。本研究結(jié)果中，多種含金屬β-內(nèi)酰胺酶的NTM標準株(如胞內(nèi)、海、恥垢、蟾蜍分枝桿菌等)檢測陰性，可見CDG-3與該類酶反應的可能性極小。因此，CDG-3熒光探針檢測瑪爾摩分枝桿菌為陽性的原因尚待明確。未來如果能夠闡明4種陽性結(jié)果的NTM及諾卡菌與CDG-3反應的機制，CDG-3熒光探針將可能得到進一步優(yōu)化。

本研究中，CDG-3熒光探針檢測臨床痰標本中MTB的陽性率(53.0%)高于其他2種檢測方法。相比于同樣需要熒光鏡檢的金胺O熒光染色法，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本實驗中，3例臨床確診為NTM病(2例胞內(nèi)分枝桿菌感染，1例鳥分枝桿菌感染)患者的痰標本，CDG-3熒光探針檢測結(jié)果皆為陰性，與標準株檢測結(jié)果相符。CDG-3熒光探針檢測痰標本MTB陽性的106例患者中，90.6%(96例)經(jīng)臨床確診為結(jié)核病患者；8.5%(9例)因未確診而無法判斷其準確性；0.9%(1例)臨床確診肺內(nèi)感染，為假陽性。筆者對6種呼吸道感染病原菌標準株進行了CDG-3熒光探針檢測，發(fā)現(xiàn)諾卡菌可表達陽性信號，其余5種為陰性；國外采用CDG-3熒光探針進行了實驗，對克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金葡菌鏡檢結(jié)果均為陰性[5]。由于呼吸道感染病原菌或正常菌群種類繁多，可能有些細菌的β-內(nèi)酰胺酶與MTB的BlaC活性相近，從而導致CDG-3檢測假陽性的情況出現(xiàn)，因此今后還應該對CDG-3熒光探針對呼吸道不同細菌的檢測結(jié)果進行分析。

以培養(yǎng)結(jié)果為標準，CDG-3熒光探針的敏感度為84.3%，高于金胺O熒光染色法(70.0%)，但未達到國外文獻報道的90%[5]；特異度為63.8%，低于金胺O熒光染色法(92.3%)。涂陰培陰標本中，CDG-3熒光探針檢測痰標本中MTB的特異度為65.8%(79/120)，低于文獻[5]中的73%。當然，不同的結(jié)果也有可能與國內(nèi)外結(jié)核病患者患病情況、標本數(shù)量及性狀、實驗室條件及操作人員的技術水平等有關。以臨床診斷為標準，CDG-3熒光探針檢測169例確診患者痰標本MTB的敏感度(64.4%)高于金胺O熒光染色法(39.6%)，但特異度(95.0%)低于金胺O熒光染色法(100.0%)。綜合來看，相較于金胺O熒光染色法，CDG-3熒光探針的敏感度較高。不過，金胺O熒光染色法直接進行痰涂片即可，而CDG-3熒光探針檢測痰標本中MTB則需要進行離心集菌，這無疑會提高CDG-3法的敏感度。從實驗結(jié)果可以看出，無論是以采用了離心集菌步驟的MGIT 960液體培養(yǎng)為標準，還是以未進行離心集菌步驟的羅氏固體培養(yǎng)為標準，CDG-3熒光探針法的敏感度都高于金胺O熒光染色法。另外，筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，利用CDG-3熒光探針鏡下檢測痰標本MTB存在一些背景雜質(zhì)的干擾，需要具有豐富經(jīng)驗的技術人員進行判斷，這是該方法仍需要改進的地方。

綜上所述，CDG-3熒光探針檢測MTB過程中，受NTM的干擾較小，對MTB的選擇性較好，但本研究受NTM病在北方發(fā)病率低等限制，今后還需加強CDG-3熒光探針于NTM病中的研究，與呼吸道感染病原菌的反應也需進一步擴大研究。該技術與金胺O熒光染色法、分枝桿菌培養(yǎng)法相比較，具有快速、簡便、檢出效率高等優(yōu)勢，對結(jié)核病的診斷具有較大的潛力，但其特異度相對較差，期望未來能夠得到進一步改進。

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