董宇杰　張莉　王宇軒　周立娟　曲楊　張晨　張海青　車南穎

淋巴結(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核中最為常見的結(jié)核病類型，約占肺外結(jié)核的30%～40%[1]。病理學(xué)診斷作為肺外結(jié)核確診的重要手段，主要采用蘇木素-伊紅(HE)染色及抗酸染色進(jìn)行診斷。結(jié)核病的主要組織病理學(xué)特征是肉芽腫性炎癥，病變內(nèi)可見類上皮細(xì)胞、郎罕巨細(xì)胞及干酪樣壞死等[2]。但由于其他感染性或非感染性疾病也可能會(huì)出現(xiàn)類似病理變化，因此僅靠形態(tài)學(xué)無法進(jìn)行確診，必須要在病灶中找到病原學(xué)依據(jù)?？顾崛旧菍ふ也≡瓕W(xué)依據(jù)的重要途徑，但其敏感度低，尋找抗酸桿菌費(fèi)時(shí)費(fèi)力[3-5]。在腫瘤等多種疾病的病理學(xué)診斷中，免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)是進(jìn)行疾病診斷、疾病分型及制定個(gè)體化治療方案的重要手段[6-8]，但在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用較少。IHC檢測(cè)的是蛋白，與檢測(cè)菌體本身相比具有更好的敏感度，且觀察更為便捷[4,9]。另外，近年來基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，如熒光定量PCR技術(shù)在痰標(biāo)本中可以檢測(cè)微量的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)特異基因序列，為結(jié)核病的診斷提供更加敏感、準(zhǔn)確的依據(jù)[10-12]；但該技術(shù)檢測(cè)組織標(biāo)本的效能還有待進(jìn)一步探討。因此，筆者應(yīng)用IHC檢測(cè)法及熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)石蠟包埋組織切片中的MTB分泌蛋白及其基因序列，并評(píng)估其在結(jié)核病病理學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、材料

1.材料：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院病理科保存的2012年1月至2013年7月之間的48例手術(shù)根治切除淋巴結(jié)結(jié)核患者(結(jié)核組)和21例非淋巴結(jié)結(jié)核患者(非結(jié)核組)的石蠟包埋組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未經(jīng)任何治療。結(jié)核組包括男16例，女32例，年齡15～74歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù)：Q1，Q3)為29(24，46)歲；其中，頸部淋巴結(jié)結(jié)核43例，腋窩淋巴結(jié)結(jié)核3例，縱隔淋巴結(jié)結(jié)核2例。非結(jié)核組包括男8例，女13例，年齡19～61歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù)：Q1，Q3)為48(33，57)歲；淋巴瘤6例、壞死性淋巴結(jié)炎5例、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生4例、淋巴結(jié)結(jié)節(jié)病6例；頸部淋巴結(jié)14例、縱隔淋巴結(jié)4例、腋窩淋巴結(jié)2例、腹股溝淋巴結(jié)1例。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)》[13]符合Ⅰ類或Ⅱ類診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者。Ⅰ類診斷標(biāo)準(zhǔn)，即病變組織及細(xì)胞病理變化符合結(jié)核病病理變化特征，且具有結(jié)核病病原學(xué)證據(jù)；Ⅱ類診斷標(biāo)準(zhǔn)，即病變組織及細(xì)胞病理變化具備結(jié)核病病理變化特征，但沒有明確結(jié)核病病原學(xué)證據(jù)，不能排除結(jié)核病可能性的可作提示性診斷。結(jié)核組均經(jīng)病理學(xué)、病原菌或術(shù)后化學(xué)治療好轉(zhuǎn)證實(shí)為淋巴結(jié)結(jié)核，以臨床最后診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)核組患者，經(jīng)病理學(xué)檢查符合Ⅰ類診斷標(biāo)準(zhǔn)者37例，符合Ⅱ類診斷標(biāo)準(zhǔn)者11例。(2)非結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：通過病理學(xué)或臨床檢測(cè)結(jié)果能明確診斷為其他淋巴結(jié)疾病。

二、方法

1.標(biāo)本處理：病灶手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)。

2.試劑及儀器：抗酸染色試劑盒購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；免疫組織化學(xué)MaxVision試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組織化學(xué)一抗為本科室自制多克隆抗體Ag85B-pAb1。石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；MTB核酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。熒光定量PCR儀為瑞士羅氏公司的Cobas Z480。

3.抗酸染色：石蠟切片厚4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水(高濃度到低濃度)后入水；經(jīng)石碳酸復(fù)紅常溫染色1 h，水洗后經(jīng)鹽酸酒精分化數(shù)秒至無紅色，再水洗；亞甲藍(lán)染色20 s，水洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性膠封片，應(yīng)用油鏡(×1000)鏡檢。結(jié)果判定：抗酸桿菌呈紅色桿狀、略彎曲、串珠狀，其他組織細(xì)胞或細(xì)菌呈藍(lán)色。

4.IHC染色：采用MaxVision一步法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色。一抗為本實(shí)驗(yàn)室自制抗體Ag85B-pAb1，稀釋比例為1∶2000。染色前切片經(jīng)高壓抗原熱修復(fù)，染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，二氨基聯(lián)苯胺(diaminnobenzidine，DAB)顯色，蘇木素對(duì)比染色。每批染色時(shí)用已知Ag85B陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。染色陽(yáng)性信號(hào)特點(diǎn)：(1)著色呈點(diǎn)簇狀、小斑片狀或小雪片狀；(2)著色部位中心顏色較深，周圍顏色漸淺；(3)著色呈多點(diǎn)狀分布；(4)常在壞死組織及周邊部位表達(dá)。

5.DNA提取及PCR檢測(cè)：石蠟切片厚4 μm，根據(jù)組織大小切5～10片，放入1.5 ml離心管中，并根據(jù)DNA提取說明書操作步驟提取DNA。熒光定量PCR按照MTB核酸測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為40 μl，反應(yīng)條件為：37 ℃ 2 min、94 ℃ 2 min、(93 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s)×40個(gè)循環(huán)，在60 ℃進(jìn)行熒光檢測(cè)。Taqman熒光探針為FAM標(biāo)記。每批檢測(cè)均設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。檢驗(yàn)結(jié)果判斷：循環(huán)數(shù)(Ct值)≤38為陽(yáng)性，Ct=40或無擴(kuò)增曲線為陰性，Ct值介于38～40之間則重新測(cè)定；如果重新測(cè)定Ct值還在38～40之間，且擴(kuò)增曲線呈S形則判定為陽(yáng)性，若為非典型曲線判定為陰性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算IHC染色、熒光定量PCR、抗酸染色等方法的檢測(cè)效能指標(biāo)，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算方法：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測(cè)人數(shù)×100%。采用χ2檢驗(yàn)比較不同檢測(cè)方法敏感度的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1.檢測(cè)結(jié)果：HE染色可見淋巴結(jié)結(jié)核光鏡下的組織學(xué)表現(xiàn)為肉芽腫病變、壞死及炎性滲出(圖1)。IHC染色結(jié)果中出現(xiàn)深棕色顆粒物為陽(yáng)性結(jié)果，顯示Ag85B蛋白的表達(dá)(圖2)。熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖中典型的擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性結(jié)果，平坦的反應(yīng)曲線為陰性結(jié)果(圖3)?？顾崛旧Y(jié)果中出現(xiàn)紅色桿狀、略彎曲、串珠狀者為抗酸桿菌(圖4)。

2. 各檢測(cè)方法對(duì)比：IHC染色、熒光定量PCR及抗酸染色檢測(cè)結(jié)核組的敏感度分別為52.1%(25/48)、60.4%(29/48)和27.1%(13/48)。IHC染色和熒光定量PCR檢測(cè)敏感度均高于抗酸染色，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為 6.27、10.84，P值分別為0.012、0.001)，而IHC染色與熒光定量PCR比較，敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.68，P=0.411)。IHC染色、熒光定量PCR及抗酸染色法檢測(cè)非結(jié)核組結(jié)果均為陰性，特異度均為100%。3種方法的陰性預(yù)測(cè)值及符合率比較，IHC染色和熒光定量PCR檢測(cè)均優(yōu)于抗酸染色(表1)。

病理組織中可見炎性滲出及較多壞死圖1　淋巴結(jié)結(jié)核病理標(biāo)本經(jīng)HE染色結(jié)果(×200)

壞死組織中可見深棕色顆粒，為目的蛋白著色圖2　淋巴結(jié)結(jié)核病理標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

共檢測(cè)11份標(biāo)本，圖中紅色曲線表示陽(yáng)性結(jié)果(6份標(biāo)本，1份陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本)，綠色曲線表示陰性結(jié)果(3份標(biāo)本，1份陰性對(duì)照)圖3　淋巴結(jié)結(jié)核病理標(biāo)本經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)方法結(jié)核組(例)非結(jié)核組(例)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性敏感度(%)特異度(%)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(%)陰性預(yù)測(cè)值(%)符合率(%)IHC染色252302152.1100.0100.047.766.7熒光定量PCR291902160.4100.0100.052.572.5抗酸染色133502127.1100.0100.037.549.3

注以臨床最后診斷為金標(biāo)準(zhǔn)

圖中呈紅色桿狀、略彎曲、串珠狀者為抗酸桿菌圖4　淋巴結(jié)結(jié)核病理標(biāo)本經(jīng)抗酸染色結(jié)果(油鏡，×1000)

討　　論

淋巴結(jié)結(jié)核屬于肺外結(jié)核，只能依靠穿刺針吸或手術(shù)切除獲得病灶組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)診斷，少數(shù)有條件的醫(yī)院可同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)。細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，僅為20%～30%，只能為少數(shù)患者提供確診依據(jù)，且診斷周期為4～6周，很難滿足為患者及時(shí)制定治療方案的臨床需求[2,14]。因此，病理學(xué)診斷是肺外結(jié)核的主要診斷手段，且目前主要靠形態(tài)學(xué)檢查及抗酸染色法，但抗酸染色法敏感度低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

本次研究筆者探討了IHC染色和熒光定量PCR技術(shù)在病理學(xué)診斷中的應(yīng)用。從檢測(cè)結(jié)果分析，這兩種方法的敏感度均高于傳統(tǒng)的抗酸染色法。IHC檢測(cè)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)，在腫瘤的診斷及分型中使用非常廣泛，但在結(jié)核病病理學(xué)診斷中應(yīng)用較少。筆者利用自制的特異識(shí)別MTB分泌蛋白Ag85B的抗體進(jìn)行了IHC檢測(cè)。Ag85B是MTB的主要分泌蛋白，是其引發(fā)人體免疫反應(yīng)的重要免疫原[15-16]，其表達(dá)量非常高，可占總分泌蛋白的5%～6%[17-18]；且它的表達(dá)不局限在MTB細(xì)胞內(nèi)，可分泌到細(xì)胞周圍的空間；因此，可提高IHC顯色信號(hào)強(qiáng)度與范圍，有助于提高檢測(cè)敏感度。但Ag85B并非MTB特有，在其他分枝桿菌中也有同源蛋白存在，因此檢測(cè)Ag85B不能鑒別診斷結(jié)核病與其他分枝桿菌病，是該方法的主要缺點(diǎn)。熒光定量PCR法檢測(cè)的是核酸，在感染性疾病診斷中應(yīng)用比較多。已有研究顯示，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)石蠟包埋結(jié)核病患者的組織標(biāo)本中MTB特異基因序列來診斷結(jié)核病，可提高骨結(jié)核的明確診斷率[19]。本次研究，筆者利用Taqman熒光定量PCR方法檢測(cè)了石蠟包埋淋巴結(jié)結(jié)核組織標(biāo)本中的MTB特異基因序列，其檢測(cè)敏感度與IHC檢測(cè)相比差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IHC檢測(cè)在高倍鏡下即可獲得明確信號(hào)，而抗酸染色法因?yàn)榫可?，大多?shù)情況下需要使用油鏡才能找到抗酸桿菌或確定為抗酸桿菌。因此，IHC檢測(cè)相比抗酸染色法可以大幅度提高閱片診斷速度。IHC檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)條件要求低，僅需要有高壓鍋進(jìn)行高壓修復(fù)，切片加入一抗后，普通冰箱4 ℃過夜，次日即可得出檢測(cè)結(jié)果，且操作步驟簡(jiǎn)單，易于掌握。

近年來，PCR技術(shù)發(fā)展迅速。除了Taqman熒光定量PCR技術(shù)，巢式實(shí)時(shí)定量PCR、高分辨率熔解曲線PCR、巢式PCR聯(lián)合變性高效液相色譜及免疫磁珠分離聯(lián)合PCR等多種新型PCR技術(shù)也陸續(xù)有報(bào)道[20-23]。因此，通過改進(jìn)和優(yōu)化方法，PCR技術(shù)的檢測(cè)敏感度還有提高空間。PCR檢測(cè)在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后能立即進(jìn)行自動(dòng)數(shù)據(jù)分析，具有更好的客觀性和重復(fù)性，并且擴(kuò)增時(shí)間僅為1.5 h。但是PCR技術(shù)要求分子實(shí)驗(yàn)室規(guī)范，并且實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員需要經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)，取得上崗資格證書。

綜上所述，IHC檢測(cè)及PCR技術(shù)相比傳統(tǒng)的抗酸染色具有敏感度高、操作簡(jiǎn)單和結(jié)果快速等優(yōu)勢(shì)，在淋巴結(jié)結(jié)核病理學(xué)診斷中較抗酸染色具有更好的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于沒有開展MTB培養(yǎng)的大多數(shù)醫(yī)院，容易推廣實(shí)施，在淋巴結(jié)結(jié)核病理學(xué)診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

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