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(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南 鄭州 450011)

酵母葡聚糖是一種具有很強(qiáng)的免疫活性類(lèi)多糖，其免疫活性可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲(chóng)的抵抗感染能力，同時(shí)在促進(jìn)機(jī)體傷口愈合和加強(qiáng)機(jī)體抗輻射等方面都具有顯著的作用, 是一種優(yōu)良的生物調(diào)節(jié)劑( BRMs) 。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)生物酶處理和化學(xué)修飾的方法增溶酵母葡聚糖，但對(duì)酵母葡聚糖的抑菌性研究則偏少, 本試驗(yàn)就酵母多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌效果進(jìn)行初步探討，為其后期的研究及實(shí)踐應(yīng)用推廣提供一定的理論參考。

1　材料

1.1　菌種

啤酒酵母、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌等,由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2　各種培養(yǎng)基的制備

酵母菌培養(yǎng)基: 酵母粉30g、瓊脂45g、葡萄糖40g、蛋白胨45g、蒸餾水1500 mL、pH6.3、121℃高壓滅菌30min；霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖30g、水1000mL,煮沸30min，pH6.7，121℃高壓滅菌30min。細(xì)菌培養(yǎng)基: 蛋白胨20g、瓊脂40g、牛肉膏10g、NaCl 10g、蒸餾水1000 mL、pH7.3，121℃高壓滅菌30min。

1.3　酵母葡聚糖的制備

稱(chēng)取酵母粉1000g溶于1000mL、6%的NaOH溶液中,加熱攪拌4h,冷卻至室溫，離心(4000 r/min，30min)；吸棄上清液，將溶解的酵母用1000mL、3%的NaOH溶液進(jìn)行懸浮, 然后將其加熱至90℃劇烈攪拌1.5h, 待冷卻至室溫后離心(4000r/min，30min)；吸棄上清液，然后加入11%的HCl充分混勻，室溫靜置2h，離心(4000 r/min，30min)；吸棄上清液，首先用H2O2洗滌3次，95%乙醇浸洗1.5h, 再用無(wú)水乙醇脫水3次, 37℃干燥12h, 所得酵母葡聚糖。

1.4　 酵母葡聚糖水溶液的制備

在所制得的酵母葡聚糖中添加一定比例的甲酸, 然后80℃降解1.5h后繼續(xù)加熱去除甲酸,待冷卻至室溫，對(duì)所得溶液通過(guò)超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，調(diào)節(jié)過(guò)濾濃縮液的pH值至7；65℃處理濃縮液20min后，將其冷凍干燥即可獲得易溶于水的酵母葡聚糖, 配制濃度45mg/mL酵母葡聚糖溶液以備用。

2　方法

2.1　菌懸液的制備

將菌種接種于培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)皿上作以標(biāo)記。細(xì)菌、霉菌和酵母菌分別置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)24h。分別挑取已經(jīng)活化的菌種置入無(wú)菌生理鹽水中,搖勻，制成菌懸液，調(diào)整其濃度為106-107cfu/mL，以備用。

2.2　酵母葡聚糖最低抑菌濃度的測(cè)定

將酵母葡聚糖水溶液分別稀釋成濃度為 20、10、5、2.5、1.25 和0.625 mg/mL的稀釋液, 分別吸取各稀釋液0.5 mL和菌懸液0.1 mL, 加在固體培養(yǎng)基上，混合后加熱至60℃，充分混勻，待其冷卻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行觀察、培養(yǎng)，以不生長(zhǎng)細(xì)菌的酵母葡聚糖溶液最低濃度為最小抑菌濃度(見(jiàn)表1)。

表1　酵母葡聚糖溶液最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)；“**”表示有少量菌落生長(zhǎng)；“***”表示有不超過(guò)1/3平皿面積的菌落生長(zhǎng)；“****”表示有不超過(guò)1/2平皿面積的菌落生長(zhǎng)；“*****”表示有超過(guò)1/2平皿面積的菌落生長(zhǎng)。

2.3　pH值對(duì)酵母葡聚糖抑菌效果的影響

取5mL其濃度為106-107cfu/mL的酵母葡聚糖溶液于燒杯中，用0.1mol/mL的NaOH和 0.1mol/mL的HCl，調(diào)制成不同pH值的酵母葡聚糖溶液：pH分別為 3、4、5、6、7、8。將濾紙片(121℃高壓滅菌、30 min)放入其中均浸泡30min，水作為空白對(duì)照。得出不同pH 值對(duì)酵母葡聚糖抑菌效果的影響(見(jiàn)表2)。

表2　pH值對(duì)酵母葡聚糖抑菌效果的影響(n=6)

2.4　溫度對(duì)酵母葡聚糖抑菌效果的影響

分別吸取5mL其濃度為106-107cfu/mL的酵母葡聚糖溶液入4個(gè)燒杯中, 將濾紙片(121℃高壓滅菌、30 min)放入其中，分別在25、50、75和100℃水中浸泡60min, 檢測(cè)不同溫度情況下濾紙片抑菌圈的大小(見(jiàn)表3)。

表3　不同溫度對(duì)酵母葡聚糖抑菌效果的影響(n=6)

3　結(jié)果與分析

由表2可看出，酵母葡聚糖對(duì)枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為10、10、20和20mg/mL，隨著溶液濃度的不斷增加，其抑菌效果也隨之增強(qiáng)。酵母葡聚糖對(duì)細(xì)菌的抑制作用依次為：大腸桿菌<沙門(mén)氏菌<枯草芽孢桿菌<金黃色葡萄球菌；由表3可看出, 溫度對(duì)酵母葡聚糖的抑菌作用有一定的影響, 隨著溫度的升高,酵母葡聚糖的抑菌效果也增加。由表4可看出, pH值在6.0-7.0范圍內(nèi)時(shí),酵母葡聚糖抑菌效果最為明顯，同時(shí)被視為酵母葡聚糖抑菌的最適pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：酵母葡聚糖對(duì)黑曲霉和啤酒酵母沒(méi)有明顯的抑制作用，而對(duì)大腸桿菌則具有明顯的抑制作用；溫度對(duì)酵母葡聚糖的抑菌效果呈正相關(guān)；pH值也影響酵母葡聚糖的抑菌效果,在pH6.7時(shí),酵母葡聚糖的抑菌效果最好。

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