，，，，

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州，450011；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

引言

豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種急性傳染病[1]。豬感染后出現(xiàn)嚴(yán)重脫水、水樣腹瀉、劇烈嘔吐等特征，尤以10日齡以內(nèi)的仔豬更為嚴(yán)重，甚至可達(dá)100%死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Jeong研究表明，感染TGEV的PK-15細(xì)胞，存在凋亡加速現(xiàn)象[2]，TGEV通過激活Bcl-2介導(dǎo)線粒體通路和FasL介導(dǎo)死亡受體通路，誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡[3]。衛(wèi)文強[4]等研究表明，黃芩、黃芪、大黃、金錢草體外對TGEV均有抑制作用。當(dāng)前對于中獸藥抗TGEV的研究主要集中在單味藥或提取物單體進(jìn)行體外抗TGEV感染和細(xì)胞的保護(hù)率上。現(xiàn)今成方中藥制劑抗病毒作用研究太少，通過SIEC感染TGEV來探討復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV誘導(dǎo)SIEC凋亡的相關(guān)基因，為中藥復(fù)方防治TGV提供理論參加。

1　材料與方法

1.1　材料

豬小腸粘膜上皮細(xì)胞(SIEC)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)張彥明教授實驗室饋贈；PK-15與TGEV購于中科學(xué)院武漢病毒研究所;中藥黨參、茯苓、白術(shù)、扁豆、陳皮、等中藥購于內(nèi)蒙古萬民藥房連鎖有限公司。

試劑

DMEM(gibco)，EGF(sigma)，HEPES(sigma)，EB(sigma)，AO(sigma),FBS(gibco)，ITS(gibco)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(ROX)，SuperSignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo),0.25%胰蛋白酶(gibco)，一抗：Bcl-2(sc-492)、Bax(sc-493)均購于美國Santa Cruz生物試劑公司,HRP標(biāo)記的兔抗山羊 IgG(聯(lián)科生物),PVDF膜(Millipore),苦參堿(阿拉丁)。

儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，離心機(Eppendorf,5430R)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，1×71)，7500 Fast Real-Time PCR儀(AB，IQ5)，DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠)，蛋白凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare， Image Quant LAS4000)，超純水機(UPH,成都超純科技有限公司)。

1.2　方法

1.2.1SIEC和PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)與TGEV的增殖

按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[5]，與TGEV病毒液(TCID50為103.8/0.1mL)的準(zhǔn)備。

1.2.2試驗分組及處理見(表1)

表1試驗分組及處理方法

1.2.3熒光染色

參照文獻(xiàn)3進(jìn)行。

1.2.4Western blot 檢測細(xì)胞凋亡主要調(diào)控因子的蛋白表達(dá)情況

將對數(shù)生長期的SIEC懸液接種于培養(yǎng)瓶中,當(dāng)SIEC約長成80%的豐度時, PBS清洗細(xì)胞2次，接入相應(yīng)藥物處理或維持液2mL，24h，棄液；再接種100TCID50 TGEV病毒液或維持液1mL，37℃孵育2h,棄病毒液,加入維持液，分別感染0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot分析[6]，結(jié)果見表1。

1.3　數(shù)據(jù)處理

用 SPSS20.0軟件分析統(tǒng)計結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1　熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化

SIEC細(xì)胞 AO/EB染色后(如圖1)：對照組只被AO染色，細(xì)胞核呈長梭形綠色熒光，胞漿內(nèi)無明顯顆粒，細(xì)胞核膜完整，核大，呈圓形或橢圓形，形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰，染色質(zhì)均勻(圖1-1)；隨時間的延長感染TGEV的模型組，其細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核發(fā)生明顯碎裂和聚縮，細(xì)胞膜失去完整性。(圖1-2～1-5)；中藥復(fù)方參術(shù)組干預(yù)感染TGEV的SIEC結(jié)構(gòu)清晰，呈長梭形，大部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)較清晰，染色質(zhì)著色均一，凋亡現(xiàn)象不明顯，但存在少量的細(xì)胞核變大或碎裂現(xiàn)象(圖1-10～1-13)；苦參堿組間于復(fù)方參術(shù)組與模型組之間(圖 1-6～1-9)。

圖1　復(fù)方參術(shù)對TGEV 感染SIEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(200×)圖1-1 正常細(xì)胞；圖1-2～1-5分別為TGEV 感染12h、24h、48h、72h；圖1-6～1-9為苦參堿組TGEV 感染12h、24h、48h、72h；圖1-10～1-13為復(fù)方參術(shù)組TGEV 感染12h、24h、48h、72h。

2.2　復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV感染SIEC的 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

圖2　復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

圖3　復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC Bax蛋白表達(dá)水平的影響

由圖2和3可知，與感染TGEV模型組比較復(fù)方參術(shù)組和苦參堿組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。復(fù)方參術(shù)組和苦參堿組Bax蛋白表達(dá)量在TGEV感染細(xì)胞4h后開始下調(diào)，對照組與感染TGEV模型組的Bax一直保持高效表達(dá) 。

2.3　復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA水平的影響

圖4表明，Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨著TGEV感染細(xì)胞時間的延長，TGEV逐漸下降，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，復(fù)方參術(shù)組極顯著(P<0.01)；與空白組相比，8h時模型組 Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量減少(P<0.01)，復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.05)；12h時模型組Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量減少，復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.01)，苦參堿組表達(dá)量增加；24h時復(fù)方參術(shù)組極顯著增加(P<0.01)；48h時復(fù)方參術(shù)組極顯著增加(P<0.01)，苦參堿組表達(dá)量增加；72h時復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.05)，苦參堿組極顯著增加(P<0.01)。這與Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果一致。

由圖5可知，隨著TGEV感染SIEC時間的延長，TGEV組Bax mRNA轉(zhuǎn)錄一直保持較高水平。復(fù)方參術(shù)Bax mRNA轉(zhuǎn)錄量隨著時間的延長表達(dá)量一直較低，與對照組和TGEV相比差異極顯著(P < 0.01)。Bax mRNA變化趨勢與蛋白表達(dá)水平一致。

3　討論

TGEV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、α冠狀病毒屬(Coronavirus)，與PEDV有較高的同源性。一旦發(fā)病，可致使仔豬大量死亡。目前對該病的防治主要有疫苗、化藥及外源性細(xì)胞因子等。由于病毒基因突變快、血清型多，為疫苗的研發(fā)與應(yīng)用帶來眾多困難；中藥抗病毒基于“祛邪”與“扶正”的理論。在于中藥可以直接殺死病毒、抑制病毒復(fù)制，而且可以提高機體免疫力，增強抗病毒功效。

圖4　復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平變化，*(P<0.05)，**(P<0.01)

圖5　復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細(xì)胞Bax mRNA水平變化，*(P<0.05)，**(P<0.01)

根據(jù)TGEV感染仔豬后的特征性癥狀，本實驗通過加減化裁經(jīng)典方劑“參苓白術(shù)散”，開展中藥復(fù)方對豬傳染性胃腸炎病毒的治療研究。

TGEV病毒通過S麥穗蛋白與宿主細(xì)胞N-pAPN結(jié)合，介導(dǎo)TGEV與SIEC細(xì)胞膜融合，最終引發(fā)病毒侵入細(xì)胞內(nèi)部并在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量的具有感染毒性的病毒粒子[3][7][8]。TGEV能夠引起細(xì)胞病變致使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡主要有兩條通路，一條為死亡受體通路，主要包括Fas和TNF等腫瘤壞死因子受體超家族；另一條為線粒體通路，線粒體處于細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心地位，其相關(guān)的基因家族主要是Bcl-2家族。其中Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生的兩個關(guān)鍵因子，通過控制Cyt-C的釋放和下游Caspase-3蛋白酶的活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)增加或Bcl-2表達(dá)下調(diào)均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9，10，11]。本實驗結(jié)果表明，SIEC感染TGEV后細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，而通過復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV感染SIEC后這一現(xiàn)象得到改善，致使細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不再明顯。

4　結(jié)論

試驗結(jié)果表明，復(fù)方參術(shù)湯可顯著增加Bcl-2的表達(dá)量，減少Bax的表達(dá)量，從而抑制TGEV誘導(dǎo)SIEC的凋亡，實現(xiàn)對SIEC的保護(hù)。

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