丁澤紅 付莉莉 顏彥 鐵韋韋 胡偉

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的薯類(lèi)作物，具有高產(chǎn)、高淀粉和耐貧瘠等特點(diǎn)，在現(xiàn)代工業(yè)和農(nóng)業(yè)中起著非常重要的作用。木薯具有發(fā)達(dá)的根系，可以忍受長(zhǎng)達(dá)4-6個(gè)月的干旱脅迫［1］。然而，在這種長(zhǎng)時(shí)間（或較為嚴(yán)重）的干旱脅迫條件下，木薯的生長(zhǎng)和發(fā)育受到顯著了的影響，最終導(dǎo)致其塊根產(chǎn)量減少［2］。作為典型的熱帶塊根作物，木薯主要種植在南北緯30°之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)。木薯對(duì)溫度非常敏感，低于14℃時(shí)木薯生長(zhǎng)會(huì)明顯變緩，低于10℃時(shí)木薯將停止生長(zhǎng)。更為嚴(yán)重的是，在極端的低溫天氣下木薯塊根產(chǎn)量會(huì)急劇下降甚至絕收［3］。因此，提高木薯抵御干旱和低溫等脅迫的抗性，對(duì)減少木薯在不良生長(zhǎng)環(huán)境下的產(chǎn)量損失具有重要指導(dǎo)意義。

脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物體內(nèi)起著調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和清除活性氧等作用［4］。在干旱、低溫、高鹽等脅迫條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)顯著增加［5-6］，其含量和植物的抗逆性呈正相關(guān)［7］。植物脯氨酸合成途徑可以分為兩種：鳥(niǎo)氨酸途徑和谷氨酸途徑。有趣地是，這兩種途徑的最后一步反應(yīng)相同，均由吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）催化完成，可見(jiàn)P5CR是脯氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶，由其催化的反應(yīng)對(duì)植物生長(zhǎng)可能至關(guān)重要，例如在擬南芥中敲除P5CR后可引起植株胚胎致死［8］。此外，在植物中超表達(dá)P5CR后，轉(zhuǎn)基因植株在脅迫條件下脯氨酸含量顯著增加，其抗逆性顯著增強(qiáng)［9］。

大多數(shù)植物中P5CR僅由1個(gè)基因編碼，它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中比較保守，屬于看家基因（Housekeeping genes）［10］。P5CR的表達(dá)在不同組織中存在顯著差異。例如，擬南芥中AtP5CR在根中表達(dá)量最高，其次是果莢、花和葉，而莖中的表達(dá)量最低［11］。P5CR的表達(dá)還受到干旱、低溫、鹽和ABA等的誘導(dǎo)。例如，擬南芥AtP5CR的表達(dá)量受到低溫、高溫和鹽脅迫的誘導(dǎo)［12-13］；黑麥草LpP5CR的表達(dá)受到鹽、PEG（Polyethylene glycol）、低溫和ABA（Abscisic acid）處理的誘導(dǎo)［14］；而小麥TaP5CR的表達(dá)則受到鹽、PEG和ABA處理的誘導(dǎo)［9］。這些研究成果為在其他植物中挖掘和鑒定P5CR的功能奠定了重要基礎(chǔ)。

迄今為止，在木薯中已經(jīng)克隆了一個(gè)P5CR，其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受到滲透脅迫的調(diào)控［6］。然而，在木薯中是否還存在其他的P5CR，它們和其他植物中P5CR的進(jìn)化關(guān)系如何以及它們是否參與了木薯干旱、低溫等脅迫響應(yīng)，仍不清楚。本研究擬采用生物信息學(xué)的方法從已完成基因組測(cè)序的植物中鑒定P5CR，并對(duì)其序列特征和進(jìn)化模式進(jìn)行分析；之后主要針對(duì)木薯MeP5CR，分析其在不同組織以及干旱、低溫等脅迫條件下的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步研究MeP5CR在木薯非生物脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他植物中P5CR的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用木薯材料為主推廣品種Ku50，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與處理 參照丁澤紅等［15］方法進(jìn)行木薯種植：將具有3-4個(gè)芽眼且粗細(xì)勻稱(chēng)的木薯莖段（長(zhǎng)度約15 cm）扦插于塑料盆（高×上直徑×下直徑 = 18.8 cm×18.5 cm×14.8 cm）中，每盆1個(gè)莖段?；|(zhì)采用蛭石與營(yíng)養(yǎng)土按照1:1的體積比進(jìn)行混合。木薯種植約10 d后進(jìn)行間苗，每盆保留1棵苗。

木薯種植60 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致植株分別進(jìn)行（1）干旱處理：采用20%的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，在處理0、3和24 h后，分別收集老葉、第一片完全展開(kāi)葉、未展開(kāi)葉和根的樣品，-80℃保存待用；（2）低溫處理：采用4℃進(jìn)行低溫脅迫處理，在0、6和24 h后分別收集第一片完全展開(kāi)葉、未展開(kāi)葉和根的樣品，-80℃保存待用。

為考察MeP5CR在不同組織中的表達(dá)變化，收集正常種植條件下木薯Ku50的葉片、葉柄、莖、須根和儲(chǔ)藏根的樣本，進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.2.2 RNA提取與qRT-PCR 用天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒提取木薯總RNA。用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存待用。用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。qRTPCR在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國(guó)）上進(jìn)行，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，按照2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［6］。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 以擬南芥［16］、水稻［17］中P5CR的蛋白質(zhì)序列為參考，用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其他物種的P5CR同源序列。在去除冗余序列之后，用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，確保每條序列都含有P5CR保守結(jié)構(gòu)域。之后，用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)；用MEGA5.2構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用ExPASy ProtParam分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 P5CR在不同物種中的分布

以擬南芥和水稻中P5CR為查詢序列，搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)，在45個(gè)物種中共找到54條P5CR序列，其中蘋(píng)果P5CR數(shù)目最多，為3個(gè)，其次是柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亞麻、大豆，為2個(gè)，在主要單子葉植物（如水稻、玉米、小米、高粱等）和雙子葉植物（如擬南芥及其近緣種鼠耳芥等）中有且僅有1個(gè)P5CR（圖1和表2）。木薯與杞柳、毛果楊親緣關(guān)系較近，它們僅有1個(gè)P5CR。除此之外，在許多低等生物如團(tuán)藻、萊菌衣藻、鹽生杜氏藻、小立碗蘚和泥炭蘚中也只有1個(gè)P5CR（圖1）。

序列特征分析表明，P5CR平均氨基酸長(zhǎng)度為282.6，最大值為347，最小值為208；平均外顯子數(shù)目為7.2，最大值為9，最小值為6（表2）。P5CR的分子量和等電點(diǎn)在不同物種之間的差別不大。相比之下，P5CR長(zhǎng)度的最大值為9 797 bp，最小值為1 174 bp，兩者相差9倍之多（表2）?？梢?jiàn)，P5CR在基因長(zhǎng)度上差別較大，且這種差異主要是由內(nèi)含子長(zhǎng)度上的差異造成的。

圖1 P5CR基因在不同物種中的分布

2.2 P5CR進(jìn)化分析

將54條P5CR氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)、聚類(lèi)后發(fā)現(xiàn)，它們可以分成12個(gè)主要組群（圖2）。其中，木薯與巨桉中P5CR的親緣關(guān)系較近，聚類(lèi)在一起（圖2-K）?？梢郧宄目吹剑魑锓N中P5CR的親緣關(guān)系與物種之間的進(jìn)化關(guān)系呈現(xiàn)很好的一致性：低

等藻類(lèi)和蘚類(lèi)植物（如團(tuán)藻、萊菌衣藻、泥炭蘚和小立碗蘚等）都聚類(lèi)在A組，單子葉植物（如水稻、高粱、玉米和二穗短柄草等）都聚類(lèi)在B組，雙子葉植物（如擬南芥、琴葉擬南芥和鼠耳芥等）都聚類(lèi)在D組，豆科植物（如大豆、菜豆和蒺藜苜蓿等）都聚類(lèi)在L組，且大多數(shù)植物中都只有1個(gè)P5CR（圖2）。不同組群之間P5CR長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，除了個(gè)別組群中P5CR的長(zhǎng)度要顯著的低于或高于其他組群，如D組（雙子葉植物）中P5CR長(zhǎng)度最?。ā? 600 bp）、F組（茄科植物）和J組（可可和雷蒙德氏棉）中P5CR長(zhǎng)度最大（＞6 000 bp），大多數(shù)組群中P5CR的長(zhǎng)度都保持在4 000 bp左右，差異不顯著（圖3）。結(jié)果表明，P5CR在各物種之間非常保守，且是單基因起源的。

表2 本研究中鑒定到的P5CR

續(xù)表

在少數(shù)物種中P5CR仍發(fā)生了2-3次重復(fù)，并可以將它們歸納成3種進(jìn)化模式。模式I：種內(nèi)進(jìn)化模式，即只在兩近緣物種中的某一物種發(fā)生重復(fù)。例如，大豆和菜豆都屬于豆科植物，親緣關(guān)系較近，大豆中有2個(gè)P5CR（GmP5CR1和GmP5CR2），而菜豆中只有1個(gè)P5CR（PvP5CR），且它們聚類(lèi)在一起（圖2-L）；模式Ⅱ：種間進(jìn)化模式，即在兩近緣物種中均發(fā)生重復(fù)。例如，卷心菜和白菜型油菜都屬于蕓苔屬植物，親緣關(guān)系較近，卷心菜和白菜型油菜中均有2個(gè)P5CR，且卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2分別和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2聚類(lèi)在一起（圖2-D）；模式Ⅲ：種間與種內(nèi)進(jìn)化模式共存。巴旦木和蘋(píng)果親緣關(guān)系較近，本研究發(fā)現(xiàn)巴旦木PpeP5CR1和蘋(píng)果MdP5CR1、MdP5CR3聚類(lèi)在一起（圖2-C），而巴旦木PpeP5CR2和蘋(píng)果MdP5CR2聚類(lèi)在一起（圖2-H）。以上結(jié)果表明，P5CR呈現(xiàn)多樣性的進(jìn)化模式。

2.3 MeP5CR在不同組織中的表達(dá)情況

采用qRT-PCR方法檢測(cè)MeP5CR在木薯不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖4）表明，MeP5CR在葉片、須根和儲(chǔ)藏根中表達(dá)量最高，且三者之間的表達(dá)量無(wú)顯著差異；MeP5CR在葉柄和莖中的表達(dá)量最低，僅是葉片中表達(dá)量的48%和51%。說(shuō)明MeP5CR主要是在木薯葉片、須根和儲(chǔ)藏根中起作用。

2.4 MeP5CR對(duì)干旱和低溫脅迫的響應(yīng)

采用qRT-PCR方法在木薯不同葉片（如第一片完全展開(kāi)葉、未展開(kāi)葉及老葉）和根中，分別檢測(cè)MeP5CR對(duì)干旱（PEG模擬）和低溫脅迫的響應(yīng)情況。在PEG脅迫條件下，在老葉中MeP5CR呈現(xiàn)先不變后下降的變化趨勢(shì)，在24 h其表達(dá)量顯著下降約36%；在第一片完全展開(kāi)葉MeP5CR呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，在3 h和24 h其表達(dá)量分別下降20%和提高1.3倍；在未展開(kāi)葉和根中，MeP5CR呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，在24 h其表達(dá)量分別下降23%和9%（圖5-A）。

在低溫脅迫條件下，在未展開(kāi)葉中MeP5CR的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，在6 h其表達(dá)量提高3.7倍，在24 h其表達(dá)量又回復(fù)到初始水平；在根中MeP5CR的表達(dá)量也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，在6 h和24 h其表達(dá)量分別提高1.9倍和下降59%；在第一片完全展開(kāi)葉中，MeP5CR的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢(shì)，在6和24 h其表達(dá)量分別提高3.4倍和5.9倍（圖5-B）。

綜上所述，MeP5CR在轉(zhuǎn)錄水平參與木薯干旱和低溫脅迫響應(yīng)。

圖2 植物中P5CR的進(jìn)化樹(shù)分析

圖3 不同組群中P5CR長(zhǎng)度的變化

圖4 MeP5CR在不同組織中的表達(dá)

3 討論

P5CR屬于看家基因，在大多數(shù)植物中有且僅有1個(gè)拷貝［10］。盡管目前已陸續(xù)從擬南芥、水稻、黑麥草、木薯等植物中克隆了P5CR［6，14，17］，但這些研究?jī)H關(guān)注于少數(shù)幾個(gè)物種的P5CR親緣關(guān)系，無(wú)法全面系統(tǒng)地了解P5CR的進(jìn)化歷史。本研究采用生物信息學(xué)方法，從已經(jīng)完成基因組測(cè)序的45個(gè)植物中共鑒定出54條P5CR序列，并考察了它們?cè)诓煌参镏械姆植记闆r（圖1）。結(jié)果表明，在主要農(nóng)作物（水稻、玉米、小米、高粱）和模式植物擬南芥中都僅有1個(gè)P5CR，與前人研究結(jié)果一致［10］。在木薯中也只有1個(gè)P5CR成員。與前人報(bào)道不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)至少在8種植物（包括蘋(píng)果、柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亞麻、大豆）中存在2-3個(gè)P5CR（圖1），暗示P5CR在這些植物中存在不一樣的進(jìn)化過(guò)程。序列特征分析表明，各植物中P5CR的氨基酸長(zhǎng)度、分子量大小、和外顯子數(shù)目相差不大，但基因長(zhǎng)度的變化幅度非常大。進(jìn)一步分析表明，基因長(zhǎng)度的變化主要是由內(nèi)含子長(zhǎng)度的變化引起的，且這種變化與物種進(jìn)化的關(guān)系非常密切（圖3）。

圖5 MeP5CR對(duì)干旱和低溫脅迫的響應(yīng)

聚類(lèi)分析表明，各物種中P5CR的親緣關(guān)系與物種之間的進(jìn)化關(guān)系呈現(xiàn)很好的一致性。而且，無(wú)論是在低等藻類(lèi)蘚類(lèi)植物中，還是在高等單子葉和雙子葉植物中，大多數(shù)物種有且僅有1個(gè)P5CR，與前人研究結(jié)果一致［10］。說(shuō)明P5CR是單基因起源的，且在各物種之間非常保守。盡管如此，仍有少數(shù)物種中的P5CR發(fā)生了2-3次重復(fù)：這些重復(fù)或只發(fā)生在某一物種內(nèi)部，如P5CR基因在大豆（GmP5CR1和GmP5CR2）中發(fā)生了一次重復(fù)，但在菜豆中沒(méi)有發(fā)生重復(fù)；或發(fā)生在某兩近緣物種分化之前，并在分化之后繼續(xù)保留在兩近緣物種中，如卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2；或以上2種情況同時(shí)發(fā)生，如巴旦木和蘋(píng)果中的P5CR基因（圖2）：產(chǎn)生這種結(jié)果的最大可能性是，在巴旦木和蘋(píng)果分化之前，P5CR基因發(fā)生一次重復(fù)，使得巴旦木和蘋(píng)果中分別保留有2個(gè)P5CR基因（PpeP5CR1和PpeP5CR2，和MdP5CR1和MdP5CR2）；在巴旦木和蘋(píng)果分化之后，巴旦木中的P5CR基因維持不變，而蘋(píng)果中的P5CR基因再次發(fā)生一次重復(fù)（如MdP5CR1發(fā)生重復(fù)獲得MdP5CR3）。這一推測(cè)從基因組結(jié)構(gòu)分析上也得到了驗(yàn)證：PpeP5CR1和PpeP5CR2、MdP5CR1和MdP5CR2在染色體上分別成串聯(lián)重復(fù)排列，且相互之間具有共線性。值得強(qiáng)調(diào)的是，本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在某一植物不存在P5CR，這可能是因?yàn)镻5CR丟失后會(huì)引起植株致死［8］。以上結(jié)果比較系統(tǒng)地闡述了P5CR在植物中的進(jìn)化方式，為進(jìn)一步研究其在不同物種中的功能奠定基礎(chǔ)。

P5CR在不同植物中非常保守，暗示它們可能具有相同的功能，在基因表達(dá)水平上通常表現(xiàn)為相同的表達(dá)模式。擬南芥中AtP5CR在莖中的表達(dá)量最低，而在根中表達(dá)量最高［11］；木薯中MeP5CR也表現(xiàn)出相同的表達(dá)模式，支持“根是脯氨酸生物合成的主要場(chǎng)所，而莖則主要是負(fù)責(zé)脯氨酸的運(yùn)輸”的結(jié)論［11］。研究表明，P5CR的表達(dá)還受到干旱、低溫、鹽和ABA等處理的誘導(dǎo)。例如，在低溫脅迫條件下，AtP5CR的表達(dá)量上升了約3倍［12］；在鹽、PEG、低溫和ABA處理?xiàng)l件下，LpP5CR的表達(dá)量被誘導(dǎo)了約2-4倍［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫條件下，MeP5CR的表達(dá)量在未展開(kāi)葉、第一片完全展開(kāi)葉、和根中分別上升了3.7倍、5.9倍和1.9倍；然而，在干旱條件下，MeP5CR的表達(dá)量卻被顯著的抑制了，暗示不同植物中P5CR對(duì)同一脅迫的響應(yīng)可能是不一樣的。本研究結(jié)果將有助于深入了解P5CR在不同植物中的進(jìn)化模式，同時(shí)也為進(jìn)一步研究MeP5CR在木薯干旱和低溫等逆境脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在不同植物中，P5CR內(nèi)含子長(zhǎng)度差別較大，而在氨基酸長(zhǎng)度、外顯子數(shù)目、等電點(diǎn)和分子量方面差別不大。在大多數(shù)植物（如木薯）中，P5CR有且僅有1個(gè)拷貝，在進(jìn)化上比較保守；而在某些植物（如大豆、蘋(píng)果等）中有2-3個(gè)拷貝，并將其進(jìn)化方式歸納為3種模式。木薯MeP5CR在葉片、須根和儲(chǔ)藏根中表達(dá)量最高，而在葉柄和莖中的表達(dá)量最低。此外，MeP5CR表達(dá)量受到低溫脅迫誘導(dǎo)、但被干旱脅迫抑制。

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