許艷俊 李靜媛

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

酵母菌在工業(yè)領(lǐng)域中的許多方面發(fā)揮著重要的作用，但工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境對于酵母并非最佳的生理環(huán)境，基中包括葡萄酒的釀造環(huán)境［1］。在發(fā)酵過程中酵母會受到各種環(huán)境因素的影響，目前已有大量文獻報道了單一環(huán)境條件對酵母的影響，如溫度、酒精、滲透壓等［2］。但實際生產(chǎn)中酵母菌面對的環(huán)境通常是由幾種因素共同作用的［3］。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前對兩種或兩種以上環(huán)境因素共同作用的研究相對較少［4］。

較低的pH 值（通常低于4）是酵母所面臨的主要脅迫［5］。培養(yǎng)液中的pH值，即氫離子濃度會影響酵母原生質(zhì)膜所帶的電荷，引起原生質(zhì)膜對某些離子滲透性的改變，從而影響酵母細胞對某些重要離子的吸收［6］。

無機離子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+和K+等）是酵母細胞生長所必須的營養(yǎng)元素［7］，其中Ca2+在保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，穩(wěn)定細胞壁的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)酶的活性等方面發(fā)揮重要的作用［8］。除此之外，作為第二信使，由鈣調(diào)蛋白（Ca2+/calmodulin）調(diào)控的生物信號傳導(dǎo)在細胞應(yīng)對環(huán)境壓力時起著關(guān)鍵作用［9］。目前研究表明Ca2+的存在可以緩解發(fā)酵過程中酒精脅迫所帶來的毒害作用。前期的研究亦得到同樣的結(jié)論，同時還發(fā)現(xiàn)Ca2+可以提高質(zhì)膜H+-ATPase 的活性［10］。質(zhì)膜 H+-ATPase是細胞質(zhì)膜上的一種重要功能蛋白，其活性依賴于介質(zhì)陽離子的濃度，如 Mg2+、K+、Ca2+等［11］。H+-ATPase 能水解ATP產(chǎn)生能量，利用水解ATP產(chǎn)生的能量將細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的H+泵到質(zhì)膜外側(cè)，產(chǎn)生跨膜pH梯度，起到平衡pH的作用［12］。

因此，Ca2+在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外H+濃度（pH）方面起著重要的作用［13］。前人的研究表明，培養(yǎng)基中pH和K+的相互作用是影響發(fā)酵進程的一個關(guān)鍵因素，當(dāng)發(fā)酵液中pH值和K+的含量均很低時，會導(dǎo)致發(fā)酵不徹底；而且只有當(dāng)pH較低的條件下，K+的促進作用才會表現(xiàn)出來［14］。Ca2+和pH值協(xié)同作用對細胞產(chǎn)生的影響目前還未見報道。

本文研究Ca2+和pH相互作用對酵母代謝的影響，并從酵母細胞膜通透性和完整性的角度探討影響酵母細胞的代謝的機制，更加系統(tǒng)地闡述Ca2+和pH協(xié)同作用對酵母細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Saccharomyces cerevisiaeAWRI R2是一株商業(yè)葡萄酒釀酒酵母，由Marivin（Australian）公司商業(yè)化，具有良好的發(fā)酵性能［15］。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。（2）模擬葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄糖10%，果糖10%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.04%， 酵 母 膏 0.1%（ 于 121℃ 滅 菌 20 min），（NH4）2SO40.2%。模擬葡萄汁培養(yǎng)基是一種模擬標(biāo)準葡萄汁的組成成分，且成分確定的培養(yǎng)基，利用此培養(yǎng)基可以保證培養(yǎng)條件的一致性，為實驗的準確性和重復(fù)性提供保證［16］。

1.1.3 試劑 高效液相的標(biāo)樣購自Sigma（Castle Hill，NSW，Australia），為色譜純；葡萄糖、果糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、（NH4）2SO4、蛋白胨、鹽酸，氫氧化鈉、丙酮、CaCl2、DNS試劑、二乙酸熒光素（FDA）溶液、碘化丙錠（PI）溶液均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌發(fā)酵條件的確定

1.2.1.1 酵母菌接種量的確定 pH確定在3.0，Ca2+濃度選擇 1×10-1、1×10-4mol/L，接種量選擇 1×106、4×106、1.2×107CFU/mL， 進 行 6組 發(fā) 酵 實 驗。28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣，測定殘?zhí)呛?，根?jù)結(jié)果確定接種量［17］。

1.2.1.2 pH和Ca2+處理水平的確定 在確定的接種量下，Ca2+濃度選擇1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4mol/L，pH設(shè)定在 3.0、3.25、3.5，進行 12組發(fā)酵試驗。28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣，測定殘?zhí)呛?，根?jù)實驗結(jié)果確定pH（L1）和Ca2+（La、Lb）的處理水平。

1.2.2 pH和Ca2+的協(xié)同作用對酵母的作用 實驗選取6個不同的發(fā)酵體系（表1），（Ca2+濃度為0時記為Lc，pH為5.5時記為L2）將菌液分別接入不同的發(fā)酵體系中，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，定期取樣考查CO2釋放量和殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.2.1 CO2釋放量的測定 每天同一時間對所有發(fā)酵瓶進行稱重，得出每天CO2的釋放量［18］。

1.2.2.2 殘?zhí)呛康臏y定 將培養(yǎng)至各時間點的模擬葡萄汁發(fā)酵培養(yǎng)液置于超凈工作臺中取樣5 mL，離心得上清液進行檢測。參照Ciani等［19］的方法，發(fā)酵液中葡萄糖和果糖的含量采用高效液相色譜法（Waters-2695），色譜條件：Bio-Rad HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm），示差檢測器（RID，waters-2414）。柱溫65℃，流速0.6 mL/min，等度洗脫，進樣量10 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。流動相為0.005 mol/L H2SO4，經(jīng)溶劑過濾器過濾，濾膜為 0.22 μm水相膜（四氟乙烯膜）。

表1 不同發(fā)酵體系的設(shè)定

1.2.3 pH和Ca2+水平對酵母細胞膜的通透性的影響

1.2.3.1 電導(dǎo)率的測定 定期量取培養(yǎng)基測定電導(dǎo)率。將電導(dǎo)率儀探測頭沒入培養(yǎng)液中，待電導(dǎo)率儀顯示屏上的數(shù)值穩(wěn)定時即可讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)［21］。

1.2.3.2 核酸和蛋白質(zhì)的測定 將發(fā)酵液于80℃水浴5 min滅酶，取經(jīng)處理的發(fā)酵液在3 000 r/min離心20 min，取上清液0.2 mL，然后用紫外分光光度計分別在260 nm和280 nm下測定核酸和蛋白質(zhì)的含量［22］。

1.2.4 pH和Ca2+水平下研究酵母細胞膜的完整性 取處于指數(shù)期的發(fā)酵液2 mL，5 000 r/min離心10 min，蒸餾水清洗一次，然后加入乙二酸熒光素（FDA）20 μL，振蕩混合均勻后加入60 μL碘化丙錠（PI）和920 μL無菌水；在室溫下避光放置5 min保證染色徹底；染色后在5 000 r/min離心5 min，用蒸餾水清洗1-2次，棄去上清液；最后用蒸餾水懸浮細胞，涂片。用熒光顯微鏡觀察、拍照和檢測，保存圖片［23］。染色時加入的乙二酸熒光素，保證其終濃度為100 μg/mL，加入的碘化丙錠，保證其終濃度為 60 μg/mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每組試驗設(shè)3個平行，試驗結(jié)果利用excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖，0.05顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 接種量的確定

在確定的pH值和Ca2+濃度下，設(shè)定不同的接種量。發(fā)酵結(jié)束后測定培養(yǎng)基中殘?zhí)呛?，實驗結(jié)果如圖1所示。

在 pH 為 3.0，Ca2+濃度分別為 1×10-1、1×10-4mol/L時，3個不同濃度接種量呈現(xiàn)的耗糖趨勢大致相同，如圖1所示。接種量為1×106CFU/mL時，培養(yǎng)基中糖消耗的最慢；接種量為4×106CFU/mL和1.2×107CFU/mL時，培養(yǎng)基中糖消耗的速度依次增加，說明不同的接種量對酵母的代謝具有明顯的影響作用。為了更好的控制代謝速度，選擇接種量為 1×106CFU/mL。

比較圖1-A和B可以看出，不同的Ca2+濃度下，消耗還原糖的速度表現(xiàn)出不同。當(dāng)Ca2+濃度為1×10-1mol/L時，在前4 d培養(yǎng)基中糖消耗比較快，第4天還原糖基本耗盡；而當(dāng)Ca2+濃度為1×10-4mol/L時，在前2 d培養(yǎng)基中糖消耗比較快，之后以相對平穩(wěn)的速度下降，到第7天才基本消耗完。這說明較高濃度的Ca2+可以促進酵母菌的代謝。

圖1 酵母菌接種量的確定

2.2 Ca2+濃度的確定

從圖2可以看出在接種量和pH值相同的情況下，隨著Ca2+的加入，酵母糖代謝的速度加快。但Ca2+濃度為1×10-1、1×10-2mol/L的發(fā)酵體系中耗糖速度差異較小。為了獲得較大的處理差異，最終確定Ca2+濃度為1×10-2、1×10-4mol/L。比較3個圖可以看出，不同pH下消耗還原糖的速度基本相似。都是在發(fā)酵第4天還原糖基本消耗完。pH值越低，還原糖在最初消耗的越快。且隨著Ca2+濃度的增加，酵母代謝糖越快。說明Ca2+起到了一定的緩解作用。

圖2 Ca2+濃度的確定

2.3 pH值的確定

在接種量和Ca2+濃度確定的條件下，pH為3.0的培養(yǎng)基中耗糖速度最慢；pH為3.25和pH為3.5的培養(yǎng)基中酵母耗糖速度逐漸增加，但差距較?。▓D3）。結(jié)合圖2結(jié)果，為了獲得較大的處理差異，確定pH值為3.0。

根據(jù)最適pH值（5.5）以及最終確定的pH（3.0）和Ca2+濃度（0、1×10-2、1×10-4mol/L）設(shè)定不同的發(fā)酵體系，如表2所示。

2.4 pH和Ca2+共同作用對酵母代謝的作用

2.4.1 CO2釋放量 由圖4可以看出，在未添加Ca2+的體系中，pH5.5條件下的CO2釋放率比pH3.0的條件下快，使CO2的釋放早2-3 d結(jié)束。結(jié)果表明低pH值明顯抑制了酵母細胞的代謝。

相同Ca2+濃度不同pH下CO2的釋放量的情況如圖5所示。當(dāng)pH為3.0時，CO2代謝速率減慢。比較圖5-A和B可以看出，隨著Ca2+的加入，不同pH值對CO2代謝的影響差距逐漸縮小，即隨著Ca2+濃度的增大，pH的影響出現(xiàn)微弱的減弱趨勢，從而可以得出Ca2+有助于緩解低pH所帶來的生理毒害作用，并且濃度越大，緩解作用越明顯。

圖3 pH的確定

表2 不同發(fā)酵體系的設(shè)定

比較圖6-A和B可以看出在低pH環(huán)境中，Ca2+對CO2釋放速率具有明顯的促進作用。而當(dāng)酵母生長在較適pH環(huán)境中，Ca2+的促進作用不明顯。

圖4 Ca2+濃度為0時不同pH對CO2釋放率的影響

圖5 相同Ca2+濃度、不同pH值對CO2釋放率的影響

由圖7可以看出，酵母在pH為3.0，Ca2+濃度為1×10-2mol/L的發(fā)酵體系中，CO2的代謝速率與在pH為5.5的體系中代謝速率無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果表明Ca2+可以加快酵母細胞CO2代謝速率和緩解pH的毒害作用，可基本抵消pH的脅迫作用。

2.4.2 還原糖的測定 如圖8-A所示，與CO2代謝相同，在未添加Ca2+的體系中，pH為5.5時酵母細胞耗糖速率較快。同樣證明低pH不利于酵母代謝。比較圖8-B和圖C看出隨著Ca2+濃度的增大，不同的pH對糖代謝影響的差距逐漸減小，同樣說明Ca2+有助于緩解低pH所帶來的生理毒害作用，并且濃度越大，緩解作用越明顯。

圖6 相同pH、不同Ca2+濃度對CO2釋放率的影響

圖7 pH和Ca2+對CO2釋放率的影響

比較圖9-A和B，與CO2代謝特征一致，當(dāng)酵母生長在較適pH環(huán)境中，Ca2+對酵母細胞的糖代謝沒有明顯影響。

由圖10可以看出，酵母在pH為3.0，Ca2+濃度為1×10-2mol/L 的發(fā)酵體系中糖的代謝速率比在pH為5.5的體系中代謝速率要慢（P＜0.05）。結(jié)果表明在糖代謝方面，Ca2+雖然可以緩解pH的毒害作用，但不能抵消pH的脅迫作用。

綜上結(jié)果表明pH和Ca2+對酵母細胞的生長表現(xiàn)出協(xié)同作用。在較適pH下，Ca2+對酵母代謝的促進作用不明顯。而當(dāng)pH較低時，Ca2+表現(xiàn)出明顯的促進作用，即Ca2+可緩解pH的毒害作用，但不能完全抵消其脅迫作用。

圖8 相同Ca2+濃度、不同pH對糖利用的影響

2.5 pH和Ca2+對酵母細胞膜通透性的作用

不同發(fā)酵體系中的發(fā)酵液電導(dǎo)率如圖11所示。相同Ca2+濃度下，相比pH5.5，pH3.0的發(fā)酵體系中電導(dǎo)率值明顯降低，說明低pH值降低酵母細胞膜的通透性。在pH為3.0時，隨著Ca2+濃度的增加，電導(dǎo)率值顯著增加，且增長幅度較大，表明細胞膜的通透性顯著增加。在pH為5.5時，隨著Ca2+濃度的增加，電導(dǎo)率值增長較為緩慢，說明當(dāng)pH不是脅迫條件的情況下，Ca2+對細胞膜通透性影響較小。

結(jié)果表明Ca2+在低pH脅迫條件下能明顯增加細胞膜的通透性，而細胞膜通透性的增加有助于胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)和細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的互換，克服胞內(nèi)產(chǎn)物的抑制作用，從而增強酵母的代謝。

圖9 相同pH、不同Ca2+濃度下對還原糖利用的影響

圖10 pH和Ca2+對糖代謝的影響

2.6 pH和Ca2+對酵母細胞膜完整性的作用

當(dāng)細胞膜完好無損時，PI不能進入細胞內(nèi)，此時主要是FDA與細胞內(nèi)的脂酶相結(jié)合產(chǎn)生熒光素，在熒光顯微鏡下產(chǎn)生綠色熒光信號。細胞膜受損之后PI染料大分子物質(zhì)才能進入細胞內(nèi)與細胞內(nèi)的核酸物質(zhì)（DNA和RNA）相結(jié)合，熒光的顏色向紅色轉(zhuǎn)變，使得死亡細胞發(fā)出紅色熒光。由圖12可知，相同Ca2+濃度下，相比于pH為5.5，pH為3.0的發(fā)酵體系中綠色細胞比率較低，根據(jù)顯色原理說明低pH值破壞酵母細胞膜的完整性，造成細胞死亡。而且當(dāng)Ca2+的濃度越低，pH為3.0的發(fā)酵體系中綠色細胞比率降低越明顯。

圖11 不同發(fā)酵體系發(fā)酵液的電導(dǎo)率

在同一pH條件下，隨著Ca2+濃度的增大，熒光顯微鏡下綠色細胞的比率越來越大，即活細胞所占的比率越來越大，說明細胞膜的完整性越來越好。但在pH3.0的發(fā)酵體系中，Ca2+的影響更加明顯。

由實驗分析可得Ca2+和pH對酵母細胞代謝影響和對細胞膜的影響作用相同，表明Ca2+可以提高細胞膜的通透性和維持對細胞壁的結(jié)構(gòu)，這與緩解pH的毒害作用密切相關(guān)。

3 討論

前人研究表明培養(yǎng)基pH和K+的相互作用是影響發(fā)酵進程的一個關(guān)鍵因素。當(dāng)發(fā)酵液中pH值和K+的含量均很低時，會造成發(fā)酵不徹底；而且只有在pH較低的條件下，K+的促進作用才會表現(xiàn)出來［24-25］。本文在此基礎(chǔ)上對Ca2+和pH的相互作用進行了相關(guān)的研究，結(jié)果證明了Ca2+和K+具有相似的作用，只有當(dāng)pH較低時，Ca2+才對酵母代謝表現(xiàn)出明顯的促進作用。

圖12 pH和Ca2+的協(xié)同作用下對酵母細胞完整性的影響

周風(fēng)帆等［26］的研究結(jié)果表明鈣離子的加人能提高低pH下水蚤的存活率［27］；孔繁翔等［28］的研究也表明當(dāng)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)量的Ca2+，會一定程度保護藻細胞中酸性磷酸酶和硝酸還原酶活性不受低pH的影響。前人的其他研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，進一步證明Ca2+能緩解低pH帶來的生理毒害作用，且只有在低pH下Ca2+才表現(xiàn)出作用。而在酵母菌的最適pH下Ca2+并沒有發(fā)揮大的作用。同時，本研究深入了解了酵母細胞的脅迫應(yīng)答機制，通過添加適當(dāng)濃度的Ca2+，更好的解決在葡萄酒發(fā)酵初期低pH對酵母細胞的毒害作用；也不會影響酵母細胞對其他重要離子的吸收，更好地控制酵母細胞的酒精發(fā)酵進程［29］。酒精發(fā)酵作為葡萄酒釀造的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，延遲和停滯（非理想狀態(tài)發(fā)酵）現(xiàn)象一直是葡萄酒釀造領(lǐng)域普遍關(guān)注的問題［30］。在本研究基礎(chǔ)上可以通過調(diào)控pH值和Ca2+的含量比例來優(yōu)化發(fā)酵進程。

由于本研究所采用的培養(yǎng)基是模擬葡萄汁培養(yǎng)基，與實際釀造葡萄酒時的葡萄汁有一定的差別，故在實際生產(chǎn)中可能會出現(xiàn)偏差，應(yīng)根據(jù)實際情況進行調(diào)整和改善，以期達到最優(yōu)結(jié)果。

4 結(jié)論

本文研究了pH和Ca2+協(xié)同作用對酵母代謝的影響，結(jié)果表明只有當(dāng)pH較低時，Ca2+才對酵母代謝表現(xiàn)出明顯的促進作用。低pH時添加Ca2+能顯增強細胞膜的通透性，有助于胞外營養(yǎng)物質(zhì)進入胞內(nèi)促進酵母細胞的生理活性及生長代謝；以及有助于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物分泌到胞外，克服胞內(nèi)產(chǎn)物的抑制作用。另外，Ca2+增強細胞膜的完整性有助于減輕外界環(huán)境對酵母細胞的抑制甚至毒害作用。由此從細胞膜的角度解釋Ca2+緩解pH生理毒害，促進酵母代謝的機制。

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