姜思源 丑天勝 李肖 黃蓉梅 謝寶貴

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002；2. 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100080）

金針菇（Flammulina velutipes）又被稱為金錢菇、小火菇，是目前食用菌消費(fèi)市場上常見的品種之一，其農(nóng)藝性狀具有菌柄細(xì)長，菌蓋小的特點(diǎn)［1］。金針菇子實(shí)體富含各類氨基酸，其中尤以精氨酸含量顯著高于其他食用菌［2］。此外，在金針菇的子實(shí)體中，菌柄部位為主要供食用的部分。因此在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，菌柄長度往往決定了金針菇商品性狀優(yōu)良與否。目前在子實(shí)體菌柄伸長機(jī)制的研究中依然以傳統(tǒng)的研究方式居多，但隨著金針菇基因組破譯和不斷豐富的分子生物學(xué)操作技術(shù)，為揭示金針菇子實(shí)體菌柄伸長發(fā)育的分子機(jī)理研究提供數(shù)據(jù)支撐［3］。

腺苷酸合成酶系（Adenylate-forming enzymes）是一類廣泛分布在生物界當(dāng)中的一種酶系，其在原核與真核生物的脂肪酸代謝、能量代謝等生理生化過程中扮演了重要角色［4］。腺苷酸合成酶的作用機(jī)制在ATP、Mg2+等輔因子的幫助下催化弱親核性的羧酸基團(tuán)與弱親電性的磷酸基團(tuán)間的聚合反應(yīng)［5-6］。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，該酶系分為3大家族，分別為 ClassI、ClassII和 ClassIII。其中，ClassI又分為3個(gè)亞族，分別為ClassIa：NRPS（Adenylation domains of nonribosomal peptide synthetases） 家 族、ClassIb：乙酰輔酶A合成酶和脂酰輔酶A合成酶家族、ClassIc：熒光素酶家族［7-9］。有研究發(fā)現(xiàn)，腺苷酸合成酶系中熒光素酶能夠催化分子氧氧化熒光素而發(fā)光的過程，其作用的實(shí)質(zhì)是該酶能夠在ATP、Mg2+輔因子的幫助下催化脂肪酸生成脂酰輔酶A，從而催化該反應(yīng)的進(jìn)行［10］。另外，該酶系在生物體內(nèi)各不同的生物過程中也起到了重要作用，如蛋白質(zhì)合成、DNA合成及次生代謝產(chǎn)物合成等［11-18］。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到金針菇編碼腺苷酸合成酶基因Fv-Afe1作為對象基因，結(jié)合生物信息學(xué)、RNAseq等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，分析了Fv-Afe1基因及其產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)，并通過熒光定量手段探究其在金針菇子實(shí)體菌柄伸長及在子實(shí)體發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

金針菇雙核菌株FL19和金針菇單核菌株L11，均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 金針菇雙核菌株FL19出菇參照呂作舟等的方法［19］，采集菌絲并在出菇后采集子實(shí)體原基、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄和成熟期菌蓋存放于-80℃，用于RNA的提取。

1.2.2 參考基因組和轉(zhuǎn)錄組 金針菇單核菌株L11基因組數(shù)據(jù)和雙核菌株H1123轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供，L11基因組登錄號為 APIA00000000（BioProject：191865）。L11基因組數(shù)據(jù)及H1123轉(zhuǎn)錄組均由深圳華大基因研究院進(jìn)行測序。

1.2.3 RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit（R6827-01）試劑盒（Omega Bio-Tek，美國）提取雙核菌絲體總RNA，然后使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Sythesis Super Mix for qPCR試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作參照試劑盒說明書。

1.2.4Fv-Afe1基因的確定及生物信息學(xué)分析 將金針菇H1123的子實(shí)體原基、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄和成熟期菌蓋的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、分析并獲取基因編號，以L11基因組數(shù)據(jù)、H1123轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考，獲取基因DNA和氨基酸序列。采用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測與分析；采用TargetP程 序（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）對蛋白質(zhì)亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析；使用TMHMM Server v. 2.0在線跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對金針菇類信息素受體家族蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

采 用Phyre2程 序（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；將驗(yàn)證后的Fv-Afe1序列提交到EBI的Interpro數(shù)據(jù)庫上預(yù)測分析其保守結(jié)構(gòu)域；并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載部分腺苷酸合成酶氨基酸序列，應(yīng)用MEGA6.0軟件采用鄰位相連法（Neighbor-Joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，Bootstrap value設(shè)為1 000［20］。參照嚴(yán)俊杰等［21］的方法，以Fv-Afe1基因序列分別向兩側(cè)延長1.5 kb 作為參考序列，采用 ZOOM軟件將轉(zhuǎn)錄組測序讀段定位至參考序列上［22］，參數(shù)設(shè)置為雙末端模式，允許堿基錯(cuò)配數(shù)設(shè)置為38 bp。對定位結(jié)果進(jìn)行分析，確定基因內(nèi)含子、外顯子。

1.2.5Fv-Afe1基因表達(dá)量分析 以Fv-Afe1全長基因序列為參照序列（Reference sequence），通過ZOOM軟件將金針菇6個(gè)生長時(shí)期的表達(dá)標(biāo)簽庫（Tag library）進(jìn)行定位（Mapping），統(tǒng)計(jì)在Fv-Afe1基因上具有唯一定位的標(biāo)簽種類及其數(shù)量并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終數(shù)據(jù)輸出用TPM（Transcript per million clean tags）表示。

TransStart TOP Green qPCR（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）的定量試劑，使用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用Primer Premier 5 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)量檢測，引物序列見表1。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法處理。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR所使用的引物

2 結(jié)果

2.1 Fv-Afe1基因結(jié)構(gòu)

Fv-Afe1在金針菇L11基因組中的ID號為gene9981，通過Blastp的結(jié)果顯示該基因含有腺苷酸合成酶的保守結(jié)構(gòu)域，屬于腺苷酸合成酶超家族成員基因，將其命名為Fv-Afe1。基因全長為967bp，通過轉(zhuǎn)錄組reads定位獲得該基因的轉(zhuǎn)錄本全長為795 bp，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子（圖1）。

圖1 Fv-Afe1基因的結(jié)構(gòu)

2.2 Fv-Afe1基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

將Fv-Afe1的氨基酸序列提交到EBI蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，InterPro結(jié)果顯示金針菇Fv-Afe1氨基酸序列含有AMP-dependent synthetase/ligase（IPR000873）結(jié)構(gòu)域和 AMP-binding enzyme，C-terminal domain（IPR025110）結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與腺苷酸合成酶氨基酸的典型結(jié)構(gòu)域保持一致，用Phyre2在線預(yù)測Fv-Afe1三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v-Afe1三級結(jié)構(gòu)被分為兩個(gè)Domain，它們之間由鉸鏈結(jié)構(gòu)（Hinge）連接，F(xiàn)v-Afe1的N端Domain結(jié)構(gòu)包括α螺旋，β桶（圖2）。從Interpro分析結(jié)果和Phyre2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，F(xiàn)v-Afe1從蛋白結(jié)構(gòu)上來看具有腺苷酸合成酶的催化活性。對該氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，F(xiàn)v-Afe1基因產(chǎn)物不具備跨膜位點(diǎn)，無信號肽存在，亞細(xì)胞定位顯示其定位于胞內(nèi)，說明該蛋白屬于胞內(nèi)酶，作用于細(xì)胞內(nèi)。

圖2 Fv-Afe1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖

2.3 Fv-Afe1基因系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載部分已明確作用、且結(jié)構(gòu)典型的腺苷酸合成酶家族氨基酸序列與Fv-Afe1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看到，F(xiàn)v-Afe1與真菌腺苷酸酶基因聚在一支，其他兩支分別為以源氏螢（Luciola cruciata）為代表熒光素酶家族和以肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）為代表的腺苷酸激酶家族。通過Fv-Afe1基因與糙皮側(cè)耳（Pleurotus osteatus）、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）、紫蠟?zāi)ⅲ↙accaria amethystina）和云芝（Trametes versicolor）的腺苷酸合成酶基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示它們之間的同源性極高，置信度達(dá)到100%。

2.4 Fv-Afe1的差異表達(dá)分析

金針菇的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析中可以得出Fv-Afe1基因在各個(gè)時(shí)期均表達(dá)，其中在伸長期菌柄表達(dá)量顯著高于其它時(shí)期，該基因在金針菇各個(gè)發(fā)育時(shí)期不同部位的熒光定量結(jié)果也符合這一規(guī)律（圖4），說明這一基因可能與金針菇菌柄伸長有較為密切的關(guān)系。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)金針菇的菌蓋和菌柄的交界處下1-2 mm 處是伸長的主要區(qū)域［23］。另外，有發(fā)現(xiàn)認(rèn)為在真菌中菌柄的伸長生長是通過吸收水分以及細(xì)胞的表面積擴(kuò)張實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞壁的松弛也使得新的物質(zhì)摻入從而適應(yīng)細(xì)胞的伸長［24］。也有研究發(fā)現(xiàn)一些酶系和轉(zhuǎn)錄因子對細(xì)胞形態(tài)建成的變化具有作用［25］。因此，菌柄伸長機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多種酶系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［26］。本研究基于基因組數(shù)據(jù)，在金針菇中鑒定獲得一個(gè)腺苷酸合成酶基因并對其基因結(jié)構(gòu)及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了詳細(xì)的分析，這對于其他擔(dān)子菌的相關(guān)研究具有一定的參考價(jià)值。

圖3 Fv-Afe1系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 Fv-Afe1基因在金針菇的6個(gè)時(shí)期的表達(dá)譜及qRTPCR的表達(dá)分析

有研究認(rèn)為金針菇菌柄伸長是受到菌褶中激素的調(diào)控，類似于植物中關(guān)于生長素的“酸生長學(xué)說”［27］。該研究認(rèn)為生長素通過結(jié)合并活化存在于質(zhì)膜上質(zhì)子泵（H+-ATP 酶），轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的氫離子到細(xì)胞壁上，降低pH值，使基質(zhì)環(huán)境處于酸性，進(jìn)而細(xì)胞壁中的一些氫鍵斷裂，同時(shí)活化了細(xì)胞壁上的多糖水解酶，催化斷裂纖維素微纖絲和葡聚糖之間連接的鍵，最終致使細(xì)胞壁變得松弛。

腺苷酸合成酶超家族廣泛存在于生物中，該家族涉及生化過程中重要的中間代謝物脂酰輔酶A和乙酰輔酶A的合成與分解，使得該家族基因能夠參與到蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)分解代謝及能量代謝等生化過程中［28-29］。而科研人員在肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）中發(fā)現(xiàn)，腺苷酸激酶的表達(dá)與其生長速率存在關(guān)聯(lián)，作用機(jī)制是通過增加ATP在機(jī)體的含量從而影響肺炎雙球菌的生長［30］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)v-Afe1在金針菇伸長菌柄時(shí)期具有最高表達(dá)，在成熟期菌柄具有次高表達(dá)，這說明該基因可能參與到了菌柄形態(tài)建成的基因調(diào)控，特別是對于菌柄的伸長過程可能起到了重要作用。但是關(guān)于該基因具體以何種方式參與到金針菇菌柄伸長過程，以及該基因位于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)何種位置還需更加深入的研究。

4 結(jié)論

氨基酸三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育顯示Fv-Afe1屬于腺苷酸合成酶超家族成員，熒光定量實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析顯示該基因在菌柄伸長期菌柄部位具有最高表達(dá)，成熟期菌柄具有次高表達(dá)，這說明該基因與菌柄伸長機(jī)制有關(guān)。

［1］ 畢志樹, 鄭國揚(yáng), 李泰輝. 廣東大型真菌志［M］. 廣州：廣東科技出版社, 1994.

［2］ 魏華, 謝俊杰. 金針菇營養(yǎng)保健作用［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997, 9（2）：92-97.

［3］ Lu YP, Chen RL, Long Y, et al. A jacalin-related lectin regulated the formation of aerial mycelium and fruiting body inFlammulina velutipes［J］. Int J Mol Sci, 2016, 17（12）：1884.

［4］Zhang Z, Zhou R, Sauder JM, et al. Structural and functional studies of fatty Acyl adenylate ligases fromE. coliandL. pneumophila［J］.J Mol Biol, 2011, 406：313-324.

［5］Bronstein I, Fortin J, Stanley PE, et al. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays［J］. Anal Biochem, 1994,219：169-181.

［6］Greer LF III, Szalay AA. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms：a review［J］. Luminescence, 2002, 17：43-73.

［7］Schmelz S, Naismith JH. Adenylate-forming enzymes［J］. Current Opinion in Structural Biology, 2009, 19：666-671.

［8］Wu R, Reger AS, Lu X, et al. The mechanism of domain alternation in the acyl-adenylate forming ligase superfamily member 4-chlorobenzoate：coenzyme A ligase［J］. Biochemistry, 2009,48：4115-4125.

［9］Weimer KM, Shane BL, Brunetto M, et al. Evolutionary basis for the coupled-domain motions inThermus thermophilusleucyl-tRNA synthetase［J］. J Biol Chem, 2009, 284（15）：10088-10099.

［10］ Perona JJ, Hou YM. Indirect readout of tRNA for aminoacylation［J］. Biochemistry, 2007, 46：10419-10432.

［11］Inouye S. Firefly luciferase：an adenylate-forming enzyme for multicatalytic functions［J］. Cell Mol Life Sci, 2010, 67 ：387-404.

［12］Schulman BA, Harper JW. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes：the apex for downstream signalling pathways［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10：319-331.

［13］Shuman S. DNA ligases：progress and prospects［J］. J Biol Chem, 2009, 284：17365-17369.

［14］Chapman-Smith A, Cronan JJE. The enzymatic biotinylation of proteins：a post-translational modification of exceptional specificity［J］. Trends Biochem Sci, 1999, 24：359-363.

［15］Chen L, Petrelli R, Felczak K, et al. Pankiewicz, Nicotinamide adenine dinucleotide based therapeutics［J］. Curr Med Chem,2008, 15：650-670.

［16］Watkins PA. Fatty acid activation, Prog［J］. Lipid Res, 1997,36：55-83.

［17］Sieber SA, Marahiel MA. Molecular mechanisms underlying nonribosomal peptide synthesis：approaches to new antibiotics［J］. Chem Rev, 2005, 105：715-738.

［18］Gulick AM. Conformational dynamics in the acyl-CoA synthetases.Adenylation domains of non-ribosomal peptide synthetases, and firefly luciferase［J］. ACS Chem Biol, 2009, 4：811-827.

［19］呂作舟, 張引芳, 等. 食用菌關(guān)鍵技術(shù)問答：金針菇 真姬菇杏鮑菇 楊樹菇［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2010：42-64.

［20］Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6. 0［J］. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30（12）：2725-2729.

［21］嚴(yán)俊杰, 郭麗羨, 趙靜靜, 等. 草菇谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶編碼基因（vv-gto1）的序列分析及其差異表達(dá)［J］. 微生物學(xué)報(bào),2014, 10：1171-1177.

［22］Zhang ZF, Lin H, Ma B. ZOOM Lite：next-generation sequencing data mapping and visualization software［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38：743-748.

［23］李繼影. 毛柄金線菌子實(shí)體菌柄細(xì)胞壁伸長生長的研究［D］.南京：南京師范大學(xué), 2005.

［24］Jacobson K, Mouritsen OG, Anderson RGW. Lipid rafts：at a crossroad between cell biology and physics［J］. Nat Cell Biol,2007, 9（1）：7-14.

［25］Guan XL, Souza CM, Pichler H, et al. Functional interactions between sphingolipids and sterols in biological membranes regulating cell physiology［J］. Mol Biol Cell, 2009, 20（7）：2083-2095.

［26］Tyler KM, Fridberg A, Toriello KM, et al. Flagellar membrane localization via association with lipid rafts［J］. J Cell Sci, 2009,122（6）：859-866.

［27］Lingwood D, Kai S. Lipid rafts as a membrane-organizing principle［J］. Science, 2010, 327（5961）：46-51.

［28］Rayle DL, Cleland R. Enhancement of wall loosening and elongation by acid solutions［J］. Plant Physiol, 1970, 46（2）：250-253.

［29］Robertson NF. Experimental control of hyphal branching and branch form in hyphomycetous fungi［J］. Journal of the Linnean Society of London, Botany, 1959, 56（366）：207-211.

［30］Thach TT, Luong TT, Lee S, et al. Adenylate kinase fromStreptococcus pneumoniaeis essential for growth through its catalytic activity［J］. FEBS Open Bio, 2014, 4 ：672-682.