王　軍　趙　醒　趙宇陽　趙　楊　劉成一　申興斌　李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北　承德　067000)

細(xì)胞分裂周期蛋白(CDC)25B屬于蘇/酪氨酸功能酶，主要發(fā)揮維持細(xì)胞正常生理功能的作用，可能與胚胎發(fā)育有關(guān)，該基因位于人類染色體20p13〔1〕，屬于CDC25家族成員，CDC25B與人類的多種惡性腫瘤相關(guān)，其重要作用是促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。在不同腫瘤組織中的檢測證實，在腫瘤的生長和細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中，CDC25B基因活性增強，過量表達(dá)，在消化道腫瘤中也有類似研究。CDC25B已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點，對其基因和蛋白的檢測可能成為腫瘤早期的生物學(xué)指標(biāo)。CDC25B的具體作用機制與細(xì)胞周期密切相關(guān)，可去除CDK1中酪氨酸的殘基，使G2～M 期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞分裂，因此本實驗應(yīng)用Western印跡及RT-PCR方法，在蛋白及分子水平聯(lián)合檢測細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1,CDC25B在胃癌組織中的表達(dá)。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本來源承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008～2014年手術(shù)切除標(biāo)本，所有患者為首次接受手術(shù)治療，術(shù)前未行任何放療及化療，術(shù)后病理證實均為胃腺癌。本組42例，男31例，女11例，年齡34～84(平均59.35)歲，高分化者15例，中分化者13例，低分化者14例。同時取距腫瘤邊緣>5 cm處作為正常黏膜組織。收集上述胃癌新鮮組織及正常胃組織，液氮保存，用于Western印跡及RT-PCR實驗。

1.2主要試劑AMV第一鏈cDNA合成試劑盒購自大連寶生物(Takara)工程有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。兔抗人CyclinD1,CDC25B單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3Western印跡實驗新鮮胃及胃癌組織，剪碎，加入苯甲基碳酰氟(PMSF)，提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TTBS)封閉液中封閉，一抗結(jié)合，過夜，室溫洗膜，每次10 min，共3次，二抗結(jié)合，室溫孵育2 h后曝光，觀察結(jié)果。

1.4RT-PCR實驗用細(xì)胞裂解液將各組細(xì)胞裂解，用TRIzol、氯仿和異丙醇提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μl。6 μl的DNA Ladder 及20 μl擴增產(chǎn)物進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，45 min)，采用ZF型 紫外透射反射分析儀攝像，采用Quantity one4.62軟件統(tǒng)計各條帶的積分光密度值，以積分光密度值比值分析各組間差異。β-actin上游引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增片段大小為250 bp。CyclinD1上游引物為5′-CACACGGACTACAGGGGAGTT-3′，下游引物為5′-GCTCTTTTTCACGGGCTCCA-3′，擴增片段大小為313 bp。CDC25B上游引物為5′-GACAGCGACTTGCTGCTCAA-3′，下游引物為5′- ATAGGGCTGGGGGAATCCAT-3′，擴增片段大小為416 bp。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1Western印跡檢測CyclinD1，CDC25B在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)CyclinD1，CDC25B在正常胃黏膜組織中的相對表達(dá)量分別為0.267±0.026、0.385±0.044，顯著低于胃癌組織中的表達(dá)(0.649±0.052、0.945±0.059，P<0.05)，見圖1。

2.2Western印跡檢測CyclinD1，CDC25B與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系不同性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤深度CyclinD1，CDC25B蛋白表達(dá)見表1。CyclinD1及CDC25B在胃癌組織的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

1，2：正常胃黏膜、胃癌組織，下圖同圖1　Western印跡檢測CyclinD1，CDC25B在胃組織中的表達(dá)

表1　Western印跡檢測CyclinD1、CDC25B與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

圖2　RT-PCR檢測CDC25B在胃黏組織中的表達(dá)

2.3RT-PCR方法檢測CyclinD1，CDC25B在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)見圖2，圖3。CyclinD1，CDC25B在正常胃黏膜組織中的相對表達(dá)量分別為0.41±0.03、0.33±0.02，顯著低于胃癌組織中的表達(dá)(0.85±0.05、0.92±0.06，P<0.05)，與Western印跡方法結(jié)果一致。

圖3　RT-PCR檢測CyclinD1在胃黏組織中的表達(dá)

3　討　論

消化道腫瘤是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤，胃癌則是消化道的常見腫瘤。同其他惡性腫瘤一樣，胃癌的發(fā)生是一個涉及多種致癌因素的復(fù)雜過程，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞的異常增殖，形成腫瘤包塊。CDC25B是CDC25家族中的重要成員，是一種雙特異性蛋白磷酸酶，該家族在1986 年被證實為有絲分裂的啟動因子〔2〕，家族還包括CDC25A和CDC25C。在各種致瘤因素的作用下，CDC25基因被活化，CDC25B蛋白合成增加，使CDK1去磷酸化，進(jìn)而活化CDK1/CyclinB復(fù)合物，結(jié)果是使CDK1/CyclinB復(fù)合物由細(xì)胞質(zhì)和中心體移到細(xì)胞核，通過正反饋作用，細(xì)胞核內(nèi)的CDK1/CyclinB復(fù)合物完全激活，促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期向M期轉(zhuǎn)化〔3〕。

陳彩萍等〔4〕應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)檢測92例三陰性浸潤性導(dǎo)管癌石蠟標(biāo)本中的CDC25B 表達(dá)情況，并分析其與三陰性浸潤性導(dǎo)管癌患者的年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后間的關(guān)系，結(jié)果顯示，三陰性浸潤性導(dǎo)管癌中CDC25B存在高表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，提示CDC25B 有望在判斷三陰性浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后方面具有重要參考價值。張國君等〔5〕檢測了CDC25B蛋白在膀胱細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞系和膀胱癌BIU-87和T24細(xì)胞系中的表達(dá)，證實膀胱癌細(xì)胞系中CDC25B表達(dá)較高。腎癌及大腸癌中也有研究證實CDC25B高表達(dá)〔6，7〕。本實驗提示CDC25B高表達(dá)可能與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。

細(xì)胞周期紊亂是腫瘤形成的重要決定因素，CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，在許多組織的癌變過程中，均檢測到CyclinD1的表達(dá)上調(diào)，目前認(rèn)為，CyclinD1的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔8〕。在食管癌〔9〕、膽管癌〔10〕等消化道腫瘤中均提示CyclinD1高表達(dá)，與本實驗檢測結(jié)果一致。

1Russell P,Urse P.CDC25+functions as an inducer in the mitotic control of fission yeast〔J〕.Cell,1986;45(1):145-53.

2Bugler B,Aranta M,Aressy B,etal.Genotoxic-ativated G2-M checkpoint exit is dependent on CDC25B phosphatase expression〔J〕.Mol Cancer Ther,2006;5(6):1446-51.

3Kaneuchi M,Sasaki M,Tanaka Y,etal.Expression and methylation status of 14-3-3sigma gene can characterize the different histological features of ovarian cancer〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004;316(4):1156-62.

4陳彩萍,陸翔,鄔萬新,等.三陰性浸潤性導(dǎo)管乳腺癌中CDC25B表達(dá)及其預(yù)后分析〔J〕.健康研究,2015;35(4):382-5.

5張國君,劉卓剛,張哲.膀胱不同細(xì)胞系中CDC25B蛋白表達(dá)及意義〔J〕.山西醫(yī)藥雜志,2012;41(7):652-3.

6于秀月,孔垂?jié)?張哲,等.CDC25B在腎癌細(xì)胞中的作用〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014;22(8):1782-5.

7余月華,王琴,鄭紅英,等.CDC25B在大腸癌中的表達(dá)及意義〔J〕.寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2013;35(11)：1022-5.

8張硯,陳衛(wèi)剛,鄭勇.CyclinD1及相關(guān)基因在食管癌中的研究進(jìn)展〔J〕.中華全科醫(yī)學(xué),2011;9(3):443-4.

9劉馨蓮,李淑蓉,孫靜,等.細(xì)胞周期蛋白在食管癌中的表達(dá)及意義〔J〕.中國實驗診斷學(xué),2012;16(7):1249-52.

10谷化平,黃勇,尚培中.細(xì)胞周期素D1和p16蛋白表達(dá)與膽管癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系〔J〕.肝膽胰外科雜志,2013;25(3):219-31.